研究人员如今正面向更广泛的研究领域开发创新应用，以用于新型研究领域、提高数据质量并扩展实验研究范围。 而这些进步的取得主要得益于日渐成熟、精湛的仪器设计和技术—特别是流式细胞术。 正是因为研究人员的需求，才推动了整个市场仪器的发展，从而产生了能够满足各种实验室需求和预算的先进流式细胞仪。
了解主要实验概念和流式细胞仪组件，包括：
- 对比大多数流式细胞仪中的不同硬件
- 荧光标记细胞光信号检测技术的重要性
- 辨别最适合重要应用（如免疫分型、肿瘤和粘性细胞等难分离样本、稀有事件的大体积需求以及特殊研究目标）的流式细胞仪流体和光学系统设计技术
通过比较技术规格、评估流体和光学系统以及参加重要技术会议获得的客观信息，使首席研究员、核心实验室管理者和研究人员可以综合考虑许多不同品牌或某一品牌，从而作出明智的购买决策。
流式细胞术通过检测液体中悬浮的单个细胞或其他微粒进行多参数性质分析。 相较于成像和PCR等其他方法，因其细胞流或微粒流可收集样品中单个细胞的信息，所以具有明显优势。 需注意，样品进入仪器并被输送至光学系统的过程需成熟、精湛技术的支持。
拥有良好流体系统的重要性
流式细胞术的强大之处在于能够对异质细胞群中单个细胞的物理特性进行定量。 这一过程需要流体系统将大量细胞输送至流式细胞仪器中，以产生具有统计学意义的数据。 为获得准确的计数和测量，进入和流过仪器的细胞流须稳定、一致。
高速流式细胞术中的重合事件
图 1. 重合率。 (A)一个细胞被激光束激发。 (B)两个细胞被激光束激发，产生双重信号。 双重或三重细胞信号会掩盖样品的真实生物特性。
细胞以混乱无组织的方式进入流式细胞仪。 理想状态下，它们排成单列通过检测激光器，从而实现独立检测，但在某些情况下，细胞会一起流过激光器（基于泊松分布或者样品含有细胞团块）。 而当一个以上细胞同时出现于激光路径中时，则称为重合事件。
两个细胞同时通过激光束，会导致难以区分目标细胞。如果其中一个细胞是阳性，另一个细胞是阴性，仪器会将该事件视为阳性信号。这种情况下，从该事件获得的数据即为重合事件且数据不可用。 聚焦系统技术为在光学系统中完成单细胞检测提供了可能性。
流体输送系统
图 2. 将细胞输送进流式细胞仪的系统。 (A)基于压力的流体系统利用样品流与样品流周围鞘流体的压力差进行运行。 (B)基于容量的流体系统可测定准确的样品体积，能实现浓度和计数测量。
基于压力和基于容量的流体系统是细胞进入流式细胞仪的两种常见机制。
含有大量细胞的样品可以通过压力流体系统快速进入仪器： 首先，使用特殊样品管形成密封环境，产生增压系统。 然后，密封的样品管会促使样品与仪器鞘液之间产生压力差，从而将细胞推入光学系统。 该系统的优势在于：可平稳输送样品、输送大体积样品并降低样品流出风险。 缺点是存在反压问题，如果维护不当，可能会发生堵塞。
基于容量的流体系统可实现更灵活的细胞输送， 它采用了测量样品精确体积并将其注入仪器的机制。 该系统的优势包括可进行绝对细胞计数和处理难分离样品，包括粘性细胞或大细胞，这是因为它不易发生反压造成的堵塞。 该系统可使用任何类型的样品管或样品板向系统输送样品，因此具有更高使用价值。
样品输送系统
图 3. 两种类型的泵。 (A)蠕动泵利用旋转头系统输送液体。 旋转头中的转子向管道施压，驱使液体向前流动。 (B注射泵抽取样品并将其注射到流体系统中。
基于压力和容量的系统利用蠕动泵或注射泵完成样品输送。
对于不太昂贵的仪器来说，蠕动泵是一种常见的低成本选择。 配有这类泵的流体系统利用一系列转动轴挤压管道而输送液体。 它可快速输送大体积样品。 但是，该技术无法提供准确的细胞计数，因为输送到仪器中的样品量随泵的旋转而上下波动。
容量输送系统采用注射泵，从而可以精确控制和测量样品体积。 注射泵能实现绝对细胞计数和样品回收。 其回收的样品可用于其他实验，如PCR和成像，或可再次储存以便用于下次运行。 容量样品输送是一种高品质、精心设计的输送系统，可将细胞精确输送至仪器中。
使悬浮细胞流入光学系统的技术
图 4. 细胞聚焦系统。
仪器可采用不同的流体学方法采集流过光学系统的单个细胞。
大多数流式细胞仪采用传统流体学聚焦技术，如流体动力学聚焦。 该技术利用鞘液与细胞样品间的压力差和速度差，推动细胞向前流动。
部分流体学系统采用声波辅助流体动力学聚焦。 该聚焦技术是对传统系统的进一步改良，利用声波将细胞聚焦于流动池的中央，再利用传统流体动力学技术将细胞输送到光学系统中。 声波聚焦技术不仅可以减少液体使用量，还可保留流体动力学聚焦的优势。 通过将声波聚焦和鞘液结合使用，可将细胞排成单列，从而实现更快的上样速度和更低的重合率。 而鞘液的少量使用也有利于保持流动池清洁并降低堵塞风险。 该技术能够使稀释样品快速流动。
样品处理
压力流体系统使用样品管进样，大多情况下一次只能处理一个样品。 对于高通量应用，这些流式细胞仪可装配独立的多孔采样器。 有些型号的仪器需要使用特殊样品管创造压力差，才能使样品进入流式细胞仪，因此不适合使用多孔板采样。
有些基于容量的流式细胞仪使用样品管和多孔板均可以完成进样。 移液管类注射器可将样品混匀并注射到仪器中。
样品板采样器可与机械臂连接，用于高通量处理多个多孔板。 这些系统具有更强大的流体学，支持多孔板的持续运行，因此可处理大体积样品。
流式细胞仪的光学元件选择
流式细胞仪中的光学系统可直接影响实验的设计和运行。其中，激光器为激发与抗体或试剂偶联的荧光基团提供光源，以用于检测和分析各种细胞组分及特性。检测器用于捕获特定波长的光并将其放大和分离，从而提供待测荧光基团的详细特定物理特性信息。激光器和检测器技术决定了实验所用荧光基团的数量和类型。因此，为获得最佳数据，有必要了解多种光学系统元件。
拥有良好光学系统的重要性
对单个细胞及其物理特性的鉴定情况取决于激光束的能量和检测系统的灵敏度。大部分实验需要使用多种荧光基团标记细胞表面和细胞内蛋白质，以便鉴定细胞群体、细胞周期、群体倍增数、凋亡和细胞活性。良好的光学系统和高品质元件可全面捕获细胞的生物学和生物化学特性。
光学系统的灵敏度和色谱范围对于检测荧光基团在色谱范围内的发射光非常重要
荧光染料的激光激发和发射波长
图 5. 荧光染料的激光激发和发射波长。 (A)具有多种荧光标记的细胞。 (B)PE和FITC均由蓝色 488 nm激光激发，具有重叠的发射光谱。 (C) 黄色 561 nm激光可激发PE，但不能激发FITC。 (D) Alexa Fluor 647染料由红色640 nm激光激发。
光谱重叠（荧光重叠）
图 6. 双重激发最大波长。 (A) PE可由488 nm激光激发。 (B) PE还可由最大激发波长为561nm的激光激发。 使用该激光激发PE，能使其更高效地发射荧光。
有些荧光基团具有多种激发波长，其激发效率也有所不同。例如，蓝色488和黄色561 nm激光都能激发荧光基团PE。蓝色488激光可在低能级激发PE。黄色561 nm激光可为荧光基团提供更多的激发能量，从而产生更多的发射光子。强发射光可分辨较小的、昏暗的细胞群体，而使用不具备黄色561nm激光的仪器可能无法观察到这些群体。
光学元件技术
激光器
图 7. 常用荧光蛋白和染料的激光波长。
市售流式细胞仪一般配有紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、绿色（532 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm） 激光器。基础仪器通常包含蓝色488 nm激光器。 增加激光器可为增加实验所用荧光基团数提供可行性。 紫色、蓝色、黄绿和红色激光器足以用于激发多色实验所用的大部分荧光基团。此外，有些流式细胞仪还配有350 nm范围内的紫外激光器，以扩大多色实验的激发和发射波长选择范围。
激光分布图
图 8. 激光对准。 (A)细胞接收到正确对准激光器的的全部激光能量。 这可确保每个细胞都具有相等的荧光基团激发能量，从而减少数据差异。 (B)激光未对准可能导致荧光基团激发能量的分布不均； 加大数据差异。
为对比实验中不同细胞间的发射荧光信号，应确保每个细胞接收到相等的激光激发能量。 正确的激光对准将产生一致的激光束输出，有助于为通过检测点的每个细胞提供最佳信号。 对准激光束产生的数据具有生物学差异，而非仪器差异。
在弱标记细胞样品中，次优级激发能量可能产生阴性结果。 激光能量不一致，会导致从细胞中收集的发射信号产生更大差异，进而造成更大的统计错误。 而激光对准偏移，可能会使流过激光束的每个细胞接收到生较少或不均等的激发能量。
图 9. 激光分布图。 (A)高斯发射分布图。 光子在中心位置密集分布且最强烈。 (B)平顶光束密度分布图覆盖了更大和更多平坦区域。 细胞通过更宽的峰顶而产生荧光。
大部分流式细胞仪采用高斯激光束。细胞必须通过光束中心，才能获得最佳激发能量。
最新开发的平顶激光分布覆盖了更大的荧光基团激发区域。 其更宽的峰顶使样品中的细胞能够均匀利用能量，有助于产生一致的结果。
激光装置
图 10. 激光装置。 (A)共线激光装置利用多个激光器聚焦于同一个检测点。 (B)空间分离的激光装置单个排列，依次聚焦于通过检测点的细胞。
仪器中的多个激光器进行通常采用 两种排列方式。 激光装置会影响实验所用的荧光基团数量以及细胞荧光的检测。
共线装置的所有激光器同时发射激光，并聚焦于同一区域，从而同时激发多种不同荧光染料。
因多种荧光信号同时发射且需要更多补偿，这种激光装置的多色组合设计灵活性较低。 共线激光装置适用于两种不同波长的激光器，用于激发几乎没有或没有重叠发射光谱的荧光染料。 比较经济的流式细胞仪可能会采用这种激光装置，以节省元件成本。
空间分离装置依次激发细胞流； 使用多种荧光基团染色的细胞依次通过各个激光束，每个检测器分别激发和检测发射光谱。 使用这类装置的优势在于：可灵活选择实验所用的染料数量； 此外，独立发射的荧光信号具有更高的灵敏度并且需要更少的补偿； 该装置在相近发射光谱中产生的荧光重叠大大减少，因此可以更容易地创建大规模多色组合。
荧光分离元件
图 11. 荧光发射。 (A)激发荧光基团在有限的波长范围内发光。 (B)有些荧光基团具有重叠的发射光谱。
激发荧光基团在有限光谱范围内发光，而不是在特定波长发光。发射荧光则需要通过光学滤光片，才能被捕获和分析。若不经过荧光分离，未过滤的多种荧光会发生重叠，导致难以分析。
图 12. 荧光分离元件。 (A)光学滤光片根据荧光波长范围分离荧光基团的发射信号。 (B)棱镜单色仪阵列将光线分到不同波长区域，并将这些区域的光聚焦到不同检测器上。
基于光学滤光片的不断开发，如今已可对使用多种荧光基团偶联抗体标记的细胞进行分析。这些光分离元件易于获取且可更换，最常用于流式细胞仪中的荧光分离。 通过组合不同的滤光片，可设计各种颜色组合，从而创建小型或大型的多色组合。这是一个经过检验的可靠系统，并具有持久耐用的元件。我们希望此类系统的滤光片易于更换，以方便不同的染料组合使用。
光谱流式细胞术与传统流式细胞术有所不同；光谱流式细胞仪利用棱镜聚焦可见光谱内的发射荧光。来自多种荧光基团的发射光会发生重叠，所以需要复杂的算法进行进一步分离。而该技术的优势在于它为有限的激光器提供了更多颜色通道。该技术仍处于开发阶段，并且某些荧光基团的计算荧光分离技术较为有限。
发射检测器
图 13. 发射检测元件。 (A)PTM捕获并放大荧光基团发射的信号。 (B)APD捕获半导体上的光子并放大信号。
来自单个细胞的发射荧光信号较弱。为方便分析，需要将发射光转换为一种可调整的数据格式。 为此，发射检测设备 捕获荧光并将光波转换为电信号； 并将独立的电信号放大，获得可供用户处理的数据。
光电倍增管（PMT）是为大多数流式细胞仪所采用的检测设备； 多个光电倍增管（PMT）排列在光路末端，可捕获每个经过滤的荧光信号。因其可以在从紫外到红外的广泛光谱范围内以线性方式捕获荧光的动态范围—非常微弱到非常明亮的信号范围，所以非常适用于多色组合实验。
其他检测设备还包括用于引导和放大发射荧光生成电子的雪崩光电二极管（APD）。对于主要基于远红外光谱内的荧光基团发射的实验， 它们可高效捕获在红外和近红外光谱区域内发射的信号。
电压设置
图 14. 电压设置。 (A)由于光电倍增管（ PMT）电压过高，使得荧光基团标记细胞的阳性发射信号不在可检测范围内并且超出刻度范围。 (B)降低电压后，可检测到阳性信号。
在流式细胞仪检测中，样品背景可能来自于细胞或样品其他成分的自发荧光。如要实现染色细胞物理特性的全面可视化，需要捕获阳性信号中的全部阴性（昏暗）信号。也就是说，需调整至理想的光电倍增管（ PMT）电压，使相关染色荧光基团与细胞的可检测（阴性）自发荧光实现最佳分离。
在运行细胞样品前，应使用荧光标准品优化流式细胞仪的光电倍增管（PMT）电压，以计算每个光电倍增管（PMT）的最佳电压。
可根据需要调整光电倍增管（PMT）电压，特别是在阳性信号过亮的情况下。调整时，用户可使用未染色的对照细胞作为背景信号的阴性对照。 而对光电倍增管（PMT）电压进行降低操作，可实现合适的阳性信号检测并降低阴性群体的强度值。
流式细胞仪检测到的荧光信号数量也会受电压设置的影响。设置更高或更低的电压，会在光电倍增管（ PMT）检测器上产生更多或更少的增益，从而实现合适的荧光信号检测。
锁定电压设置是简单流式细胞仪功能的一部分，也因此简单流式细胞仪的可检测发射荧光范围有限。调整电压设置可能比较困难，因为用户需要区分阳性细胞群体与背景。 新用户可能会设置过高或过低的电压。 为帮助这些用户，小型荧光染料组合及其相关检测器的电压会被锁定。 具有锁定设置的仪器因限制了电压设置的更改，从而可以实现工作流程的简化。
未锁定或可调整的电压设置更适用于运行多色组合实验的用户。锁定电压设置是为检测小型荧光染料组合的发射荧光而预先设定。而可调整的电压设置则不局限于一组荧光染料组合，因此适用于采用更大染料组合或更多种类染料的用户。此外，可调整的电压设置还可使用户检查阳性单染色对照，从而将其光电倍增管（PMT）信号调整至刻度范围内。作为多参数流式细胞术实验的一部分，通过调整光电倍增管（PMT）电压还可获得最佳信号补偿。
荧光补偿
图 15. 补偿。 (A)重叠发射信号可产生假阳性数据点。 (B)通过补偿数据去除了重叠的发射荧光。 补偿数据点将产生更准确的结果。
多种荧光基团的发射产生一系列可见光。从多色荧光染料组合收集得到的数据将具有重叠的荧光信号。这就可能导致阳性单标记细胞作为双阳性细胞出现。
图 16. 补偿技术。 (A)传统补偿技术采用经充分研究的系列算法组合，分析来自荧光基团、阴性设门或未染色对照的数据，从而将重叠发射光转变为单色光。 (B)混合光谱分解技术采用约束泊松回归或非负矩阵分解等算法，将重叠发射光转变为单色光。
补偿指的是利用一系列算法分离每个荧光基团的信号的过程。 传统补偿技术分离特定波长： 首先单独检测每个荧光基团，然后利用算法创建校正值矩阵； 这些校正值会用于光谱重叠，以产生独立的数值。 此过程可简单、快速得计算信号补偿。
与传统补偿技术相比，混合光谱分解技术的不同之处在于可提供单个波长的发射光光谱。
实验中的通道和荧光基团数量
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图 17. 通道。 (A) 单激光器系统可以具有多个通道。 (B)发射光发生重叠并且需要补偿。 (C)3-激光器系统配备了更多检测器，因此具有更多通道。 (D)通道增多，使得荧光基团选择增多且所需补偿减少。
捕获光电倍增管（ PMT）和雪崩光电二极管（APD）中发射光的元件被称为通道。 流式细胞仪检测到的荧光基团数由可用通道的数量决定。
单激光器系统可以具有多个通道。这意味着单激光器可激发多种荧光基团，并且检测器可捕获样品在不同波长处的发射光。 但这类实验需要复杂的补偿，因为所有荧光基团的发射光都具有重叠的波长范围。
多激光器的优势在于具有更多通道。多通道可使荧光基团选择增多，所需补偿减少，组合设计也愈加容易。 此外，还可提高实验的细胞群体分辨率。
仪器维护
流式细胞仪是一种持久耐用的精密仪器， 其大部分组件都是永久性固定装置。 定期维护和常规清洁可最大限度减少其零件更换，并且有助于获得高质量数据。
仪器清洁和维护的重要性
图 18. 因维护不当产生的常见污染物 (A)遗留物指来自之前样品的细胞或颗粒污染物。 (B)与核酸结合的染料是粘性的并且可产生背景噪音。 (C)微生物可在流式细胞仪的流体瓶和其他组件内生长。
如果不对仪器进行定期清洁，会出现以往样品材料不断累积的问题。
以往样品的遗留细胞问题是灵敏性实验的一大障碍，如检测稀有细胞； 它会使假阳性率升高。 通过在不同样品进样之间或实验结束后对管道进行冲洗，可减少先前实验遗留的细胞或颗粒数量。
定期清洁可防止荧光染料累积；某些染料（如核酸染料）更易于发生累积。 粘性染料、细胞和残骸的积聚会增加管道堵塞几率。 运行细胞培养物或组织样品的仪器更容易发生细菌污染； 其标志包括废液瓶中出现浑浊液体，以及空白样品中的事件积聚数量增加。 可根据生产说明书，使用洗涤液或漂洗液冲洗整个系统，防止微生物生长。
常规清洁
图 19. 每日清洁。 (A)在不同样品进样之间，使用漂洗液和去离子水冲洗管道。 部分仪器可以自动进行清洁。 (B)启动和每日关机清洁程序有助于防止染料和细胞遗留物的累积。 (C)其他日常维护检查涉及由软件引导的自动化清洁方案。
通过清洁可最大限度减少样品间污染。 不同用户进行实验之间，大多数制造商都会建议用户在运行下一个实验之前依次使用10%漂洗液和去离子水冲洗管道。 部分仪器可在不同样品进样之间进行自动清洁。
大部分系统需要在使用前和每日工作结束时使用去离子水和洗涤液进行冲洗，以去除流式细胞仪管道和流动池中的细胞和染料。 有关启动和关机清洁方案详细介绍，多见于用户手册。 日常维护有助于确保流体管道和流动池不含微生物或以往样品污染物。
部分流式细胞仪还有其他每日维护要求，包括液体池处理、检查困在过滤器中的气泡以及排空废液箱。 部分流式细胞仪还具有由软件引导的自动化清洁方案。 该等自动化系统通过删减某些任务，如气泡检查或关机程序，可减少用户工作量。 总之，这些方案都可节省时间并实现合理的清洁。
流体净化
图 20. 流体系统维护。 (A–F)清洁或更换流式细胞仪零件，以维护正常仪器性能并最大限度减少遗留物、背景噪音和微生物污染。
通过结合流体冲洗、鞘液过滤器更换和深度仪器清洁，可去除遗留物、荧光染料和微生物。 大部分流式细胞仪需要每2周至每月对鞘液管、废液管、流体容器和流动池进行一次深度清洁， 以防止残骸累积并清除生物危害性材料和微生物。
根据流体系统的类型，确定是否需要取出和更换或清洁组件。 蠕动泵系统需要每6个月至每年取出和更换一次导管。 若不更换，污染物或残骸则会在事件收集过程中不断积累。 压力系统需要定期维护喷嘴及相关零件，以便样品能够快速进入流式细胞仪。 注射泵系统还需要清洁注射器，以减少污染细胞。 注意遵循用户手册和日志维护，以确保数据的完整性。
对比技术规格文档
技术规格表的用途
流式细胞仪制造商提供的技术规格表（技术规格或规格表）描述了仪器的主要性能特点，可为想要购买流式细胞仪的用户提供大量信息。 然而，尽管采用相同的术语，但不同技术规格表因使用的数值计算方法不同，亦会难以对比。
技术规格表可助您了解流式细胞仪的设计属性，如性能、尺寸大小、环境和软件，从而确定仪器是否适合您的研究。
对比多家制造商的仪器规格
Technical specifications can be used as a basis for comparison, helping you assess the value of different instruments for the price. The spec sheet is also a guide to the performance that the manufacturer will warrant. For this reason, you should have a good understanding of the stated values and how they pertain to your intended use of the instrument. When using the spec sheet as a comparison guide across platforms, be inquisitive. There are many performance values that appear comparable across instruments but in reality are quite different. A specification is derived from a specific test or calculation, but these tests are not standardized across instrument developers and may be misleading in a side-by-side comparison.
Comparing various tech specs can be challenging because their values may have been calculated in different ways, despite sharing the same terminology. This white paper provides helpful hints about how to decipher the variations.
技术规格可作为对比的基础，助您评估不同仪器的定价和价值。 技术规格表还可助您了解制造商所保证的仪器性能。 因此，您可充分了解仪器标明的价值以及是否符合您的预期用途。 在使用技术规格表作为仪器对比指南时，应进行全面彻底的了解。 不同仪器间，许多性能值看似接近，实际却大有不同。 规格数值均来自于特定的测试或计算，但是不同仪器开发商采用的测试方法并不相同，因此可能导致错误的横向对比。
不同制造商提供的技术规格表分节也可能大不相同，这也进一步增加了差异性。 图1-8以 Invitrogen Attune NxT流式细胞仪的技术规格表为例，描述了常见的发布信息分类。 该表讨论了在流式细胞仪评估期间需要特别注意的主要规格，包括关于如何破解差异的实用技巧。
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图 1. 流体系统。 流式细胞仪的流体系统将样品管中的样品输送至流动池。 样品通过流动池（并通过激光和检测器）后，则被运送到废液中。 技术规格表中的流体系统部分提供了关于样品、体积、流速、流动池和流体容量的信息。
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图 2. 光学系统。 作为分析平台，流式细胞术依赖于激光对单个细胞的检测以及对产生荧光和散射光的信号收集。 光学元件可处理仪器内的光照和光线收集。 技术规格表中的光学系统部分概述了光学系统规格，如激光器类型和功率、激光分布、激光对准和光电倍增管（PMT）。
特别注意：激光功率
单位为mW
功率规格常被定义为由激光制造商发布的激光输出量（图2）。 但是，标明的功率规格并不一定与检测点的实际输出功率相一致、相对应，因为光线在激光器和流动池之间的光学元件内损失可能很大。 而且不同系统的光损失也各不相同。 高度光损失表示部分激光功率未在实验中未被充分利用；光损失减少表示流动池的激光强度增加，导致荧光基团的激发增强和灵敏度升高。 由于存在这些差异性，所以即使技术规格表上激光功率数值较高，也并不代表该仪器比其他仪器更灵敏。
如何对比
在对比仪器时，应谨慎对待这些规格数值。 大部分制造商不会报告到达流动池时的实际功率，但要知道这正是需要对比之处。
特别注意：针孔和激光对准设计
此规格（并非每个制造商都会报告）是指决定是否每个激光器生成的荧光信号均在检测器（也称PMT）上被分离的针孔数量。 选择时，您需了解激光器是根据内部针孔呈空间分离式排列还是共线排列。 针孔可实现荧光基团的最大激发并将激光光线交叉干扰降至最低。 许多流式细胞仪制造商采用共线激光装置。 当激光器以共线形式对准通过单个针孔，来自多个激光器的信号则共用同一条光路。 这种配置意味着，由不同激光器激发的多种染料的信号将被同一个检测器检测，而这会影响补偿值并导致分析困难。 此外，其还存在对对准问题敏感（如果光束未完全共线，会增加重合率）或对昏暗标记灵敏度低的问题。 另一种可选设计为空间分离系统(图2)。 这种配置具有多种优势，包括无对准问题、具有更多激光颜色选择以及改善的多色组合补偿。
如何对比
务必了解每个针孔对应的激光器类型和数量，并确定系统采用的是空间分离亦或共线激光器。
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图 3. 性能。 在制造商广泛发布的标准规格中，技术规格表的性能部分包含几种常见特性，如MESF计算、数据采集速率以及前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数。
特别注意：最大事件率或理论最大事件率
单位为事件数/秒
事件率是指通过仪器检测点的细胞或颗粒的实际数量。 有两种几乎完全不同的方法可用于确定该数值，通常都采用相同的单位表示（即，事件数/秒）。 这两种事件率计算方法为：
- 评估电子元件处理事件的最高速度
- 评估达到指定重合率时的最大事件率
了解制造商如何计算技术规格表中的该数值十分重要！
方法1
此方法为理论意义上的方法，它忽略了重合率以及其他仪器设计特点，如系统流体学。 因此，尽管电子元件能够以 10,000–100,000事件数/秒的速度处理事件，但根据泊松分布，该事件率对应的重合率可能远远超过普遍接受的10%速率极限。 近年来，随着更快速（但不一定是更高质量的）电子电路的出现，这种事件率规格计算方式正日益受到认可；但注意，这种事件率计算方式未将重合事件考虑在内。
方法2
此种仪器事件率计算方法是基于重合率的10%水平，这对研究人员来说更有意义(图3)。 重合率越低，表示数据完整度越高。 因此，使用这种方法最能代表可用于生成高质量数据的实际事件率对应的可接受重合率。 若制造商使用该方法计算事件率规格，则用户可以更加确信数据在指定事件率对应的可接受重合率水平范围内。
如何对比
在对比仪器时，您应确保了解制造商采用何种方法计算事件率规格数值。 制造商如使用第一种方法（电子元件处理速度）进行计算，您需在运行样品时仔细检查重合率。
特别注意：遗留率
遗留率是指遗留并污染下一个样品的原始样品量，样品遗留将导致数据不准确(图3)。 遗留率的测量方法通常是先获取样品的固定体积，再获取无颗粒缓冲液（如，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS））的固定体积。 随后，鉴别缓冲液中代表污染细胞的事件。 许多制造商通过运行特定细胞系或磁珠，确定指定条件下的遗留率数值。
如何对比
了解具体的指定条件以及使用哪种样品确定遗留率数值十分重要。 例如，规格测试所用的洗涤次数或者颗粒或细胞的大小或类型，可能与研究人员所用的完全不同。 咨询制造商如何计算其遗留率数值。 了解不同制造商使用的不同计算方法，可助您根据规格数值直接对比遗留率。
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图 4. 软件。 技术规格表的软件部分可使研究人员了解系统内置软件的功能和特点。 该部分还对功能范围、用户定义功能、维护特点以及用户账户管理进行了说明。 不同制造商生产的仪器具有不同的软件特点，有些系统配有独特的专有功能选项。
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图 5. 质量和监管。 质量和监管规格是指制造完整性、保修、现场安装工程程序和ISO认证。
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图 6. 数据管理。 数据管理部分对于成功的计算机安装和设置至关重要。 这一部分详述了RAM、硬盘驱动和FSC格式等规格。
特别注意：操作温度
单位为°C或°F
该规格常被忽视，但对仪器的终身使用价值非常重要，因为光学对准和流体学与这些数值都密切相关(图7)。
如何对比
确定实验室是否处于相对恒定的温度以及仪器是否会在不同地方使用。 仪器性能仅在规定温度范围内经过测试且具有保证，因此，一定要注意操作条件。
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图 7. 安装要求。 标准要求部分描述了仪器的环境影响、操作条件和占地等信息。
特别注意：尺寸和重量
高 x 宽x 深，单位为厘米（cm）或英寸（in.）；仪器重量单位为千克（kg）或磅（lb）
考虑仪器是否能够放置在通风橱内的预定空间或区域内。 务必考虑自动采样器等配件的空间要求，并了解流体系统是否需要空间(图7)。 许多流式细胞仪都具有外部流体系统，这大大增加了仪器所需的整体空间。 如果仪器需要定期转移，应考虑其困难性。 应注意，并非所有台式仪器都具有相同的空间需求或可转移性。
如何对比
在演示时，应要求查看已安装所有组件的完整系统，从而可以直接对比每个系统所需的空间。
特别注意：样品板分析速度
单位为分钟/96或384孔板
样品板分析速度通常是指完整分析一个96或384孔板所需的时间(图8)。 该定义包含两方面内容：一、样品体积；二、样品处理速度。 应注意，该规格中报告的时间值越低，可能代表数据质量的损失越大。 同时，务必明确在计算该数值时所用的分析样品体积以及样品处理速度。 有些制造商展示的是通过收集小体积样品而最大限度减少样品板处理时间的规格图。 但这种操作实际上需要高度浓缩的样品，并会导致产生数据质量问题，如较高的重合率和中断率。 反之如果样品浓度不足，则小体积进样可能导致事件数过少而不具有统计学意义。
样品处理速度（样品进入流体系统的速度）还会影响数据质量。 在采用流体动力学聚焦技术的流式细胞仪中，当流速增加时样品轴流会变宽并会造成细胞更广的分布（图2）。 样品处理速度升高，将导致变异性增大、检测精确度降低以及数据质量降低。 在采用声波辅助流体动力学聚焦技术的仪器中，细胞紧密排列在细胞流的中心，不受样品处理速度的影响，所以信号变异性更低，数据质量更高。 因此，如果您选择通过提高样品输入速度来缩短样品板处理时间，您应使用采用声波聚焦技术的仪器，以避免数据质量降低。
样品板分析速度的另一个影响因素是在不同样品进样之间是否冲洗探针的问题。 冲洗探针会延迟样品板分析时间，但不冲洗探针可能会增加残留率—这是在指定规格条件下运行实验前需要考虑的一个因素。
如何对比
务必了解达到制造商技术规格表所述时间可能产生的数据质量损失。
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图 8. 采样器规格。 采样设备是流式细胞仪的配件。 其规格包括采集时间、遗留率和混合方法。 其他信息还可能包括兼容的样品板类型以及流体系统选择。
结论
务必咨询与指定规格数值相关的测试，从而确保您准确对比了仪器的性能。
流式细胞仪的流体系统硬件
流式细胞术通过检测液体中悬浮的单个细胞或其他微粒进行多参数性质分析。 相较于成像和PCR等其他方法，因其细胞流或微粒流可收集样品中单个细胞的信息，所以具有明显优势。 需注意，样品进入仪器并被输送至光学系统的过程需成熟、精湛技术的支持。
拥有良好流体系统的重要性
流式细胞术的强大之处在于能够对异质细胞群中单个细胞的物理特性进行定量。 这一过程需要流体系统将大量细胞输送至流式细胞仪器中，以产生具有统计学意义的数据。 为获得准确的计数和测量，进入和流过仪器的细胞流须稳定、一致。
高速流式细胞术中的重合事件
图 1. 重合率。 (A)一个细胞被激光束激发。 (B)两个细胞被激光束激发，产生双重信号。 双重或三重细胞信号会掩盖样品的真实生物特性。
细胞以混乱无组织的方式进入流式细胞仪。 理想状态下，它们排成单列通过检测激光器，从而实现独立检测，但在某些情况下，细胞会一起流过激光器（基于泊松分布或者样品含有细胞团块）。 而当一个以上细胞同时出现于激光路径中时，则称为重合事件。
两个细胞同时通过激光束，会导致难以区分目标细胞。如果其中一个细胞是阳性，另一个细胞是阴性，仪器会将该事件视为阳性信号。这种情况下，从该事件获得的数据即为重合事件且数据不可用。 聚焦系统技术为在光学系统中完成单细胞检测提供了可能性。
流体输送系统
图 2. 将细胞输送进流式细胞仪的系统。 (A)基于压力的流体系统利用样品流与样品流周围鞘流体的压力差进行运行。 (B)基于容量的流体系统可测定准确的样品体积，能实现浓度和计数测量。
基于压力和基于容量的流体系统是细胞进入流式细胞仪的两种常见机制。
含有大量细胞的样品可以通过压力流体系统快速进入仪器： 首先，使用特殊样品管形成密封环境，产生增压系统。 然后，密封的样品管会促使样品与仪器鞘液之间产生压力差，从而将细胞推入光学系统。 该系统的优势在于：可平稳输送样品、输送大体积样品并降低样品流出风险。 缺点是存在反压问题，如果维护不当，可能会发生堵塞。
基于容量的流体系统可实现更灵活的细胞输送， 它采用了测量样品精确体积并将其注入仪器的机制。 该系统的优势包括可进行绝对细胞计数和处理难分离样品，包括粘性细胞或大细胞，这是因为它不易发生反压造成的堵塞。 该系统可使用任何类型的样品管或样品板向系统输送样品，因此具有更高使用价值。
样品输送系统
图 3. 两种类型的泵。 (A)蠕动泵利用旋转头系统输送液体。 旋转头中的转子向管道施压，驱使液体向前流动。 (B注射泵抽取样品并将其注射到流体系统中。
基于压力和容量的系统利用蠕动泵或注射泵完成样品输送。
对于不太昂贵的仪器来说，蠕动泵是一种常见的低成本选择。 配有这类泵的流体系统利用一系列转动轴挤压管道而输送液体。 它可快速输送大体积样品。 但是，该技术无法提供准确的细胞计数，因为输送到仪器中的样品量随泵的旋转而上下波动。
容量输送系统采用注射泵，从而可以精确控制和测量样品体积。 注射泵能实现绝对细胞计数和样品回收。 其回收的样品可用于其他实验，如PCR和成像，或可再次储存以便用于下次运行。 容量样品输送是一种高品质、精心设计的输送系统，可将细胞精确输送至仪器中。
使悬浮细胞流入光学系统的技术
图 4. 细胞聚焦系统。
仪器可采用不同的流体学方法采集流过光学系统的单个细胞。
大多数流式细胞仪采用传统流体学聚焦技术，如流体动力学聚焦。 该技术利用鞘液与细胞样品间的压力差和速度差，推动细胞向前流动。
部分流体学系统采用声波辅助流体动力学聚焦。 该聚焦技术是对传统系统的进一步改良，利用声波将细胞聚焦于流动池的中央，再利用传统流体动力学技术将细胞输送到光学系统中。 声波聚焦技术不仅可以减少液体使用量，还可保留流体动力学聚焦的优势。 通过将声波聚焦和鞘液结合使用，可将细胞排成单列，从而实现更快的上样速度和更低的重合率。 而鞘液的少量使用也有利于保持流动池清洁并降低堵塞风险。 该技术能够使稀释样品快速流动。
样品处理
压力流体系统使用样品管进样，大多情况下一次只能处理一个样品。 对于高通量应用，这些流式细胞仪可装配独立的多孔采样器。 有些型号的仪器需要使用特殊样品管创造压力差，才能使样品进入流式细胞仪，因此不适合使用多孔板采样。
有些基于容量的流式细胞仪使用样品管和多孔板均可以完成进样。 移液管类注射器可将样品混匀并注射到仪器中。
样品板采样器可与机械臂连接，用于高通量处理多个多孔板。 这些系统具有更强大的流体学，支持多孔板的持续运行，因此可处理大体积样品。
流式细胞仪的光学元件选择
流式细胞仪中的光学系统可直接影响实验的设计和运行。其中，激光器为激发与抗体或试剂偶联的荧光基团提供光源，以用于检测和分析各种细胞组分及特性。检测器用于捕获特定波长的光并将其放大和分离，从而提供待测荧光基团的详细特定物理特性信息。激光器和检测器技术决定了实验所用荧光基团的数量和类型。因此，为获得最佳数据，有必要了解多种光学系统元件。
拥有良好光学系统的重要性
对单个细胞及其物理特性的鉴定情况取决于激光束的能量和检测系统的灵敏度。大部分实验需要使用多种荧光基团标记细胞表面和细胞内蛋白质，以便鉴定细胞群体、细胞周期、群体倍增数、凋亡和细胞活性。良好的光学系统和高品质元件可全面捕获细胞的生物学和生物化学特性。
光学系统的灵敏度和色谱范围对于检测荧光基团在色谱范围内的发射光非常重要
荧光染料的激光激发和发射波长
图 5. 荧光染料的激光激发和发射波长。 (A)具有多种荧光标记的细胞。 (B)PE和FITC均由蓝色 488 nm激光激发，具有重叠的发射光谱。 (C) 黄色 561 nm激光可激发PE，但不能激发FITC。 (D) Alexa Fluor 647染料由红色640 nm激光激发。
光谱重叠（荧光重叠）
图 6. 双重激发最大波长。 (A) PE可由488 nm激光激发。 (B) PE还可由最大激发波长为561nm的激光激发。 使用该激光激发PE，能使其更高效地发射荧光。
有些荧光基团具有多种激发波长，其激发效率也有所不同。例如，蓝色488和黄色561 nm激光都能激发荧光基团PE。蓝色488激光可在低能级激发PE。黄色561 nm激光可为荧光基团提供更多的激发能量，从而产生更多的发射光子。强发射光可分辨较小的、昏暗的细胞群体，而使用不具备黄色561nm激光的仪器可能无法观察到这些群体。
光学元件技术
激光器
图 7. 常用荧光蛋白和染料的激光波长。
市售流式细胞仪一般配有紫色（405 nm）、蓝色（488 nm）、绿色（532 nm）、黄色（561 nm）和红色（640 nm） 激光器。基础仪器通常包含蓝色488 nm激光器。 增加激光器可为增加实验所用荧光基团数提供可行性。 紫色、蓝色、黄绿和红色激光器足以用于激发多色实验所用的大部分荧光基团。此外，有些流式细胞仪还配有350 nm范围内的紫外激光器，以扩大多色实验的激发和发射波长选择范围。
激光分布图
图 8. 激光对准。 (A)细胞接收到正确对准激光器的的全部激光能量。 这可确保每个细胞都具有相等的荧光基团激发能量，从而减少数据差异。 (B)激光未对准可能导致荧光基团激发能量的分布不均； 加大数据差异。
为对比实验中不同细胞间的发射荧光信号，应确保每个细胞接收到相等的激光激发能量。 正确的激光对准将产生一致的激光束输出，有助于为通过检测点的每个细胞提供最佳信号。 对准激光束产生的数据具有生物学差异，而非仪器差异。
在弱标记细胞样品中，次优级激发能量可能产生阴性结果。 激光能量不一致，会导致从细胞中收集的发射信号产生更大差异，进而造成更大的统计错误。 而激光对准偏移，可能会使流过激光束的每个细胞接收到生较少或不均等的激发能量。
图 9. 激光分布图。 (A)高斯发射分布图。 光子在中心位置密集分布且最强烈。 (B)平顶光束密度分布图覆盖了更大和更多平坦区域。 细胞通过更宽的峰顶而产生荧光。
大部分流式细胞仪采用高斯激光束。细胞必须通过光束中心，才能获得最佳激发能量。
最新开发的平顶激光分布覆盖了更大的荧光基团激发区域。 其更宽的峰顶使样品中的细胞能够均匀利用能量，有助于产生一致的结果。
激光装置
图 10. 激光装置。 (A)共线激光装置利用多个激光器聚焦于同一个检测点。 (B)空间分离的激光装置单个排列，依次聚焦于通过检测点的细胞。
仪器中的多个激光器进行通常采用 两种排列方式。 激光装置会影响实验所用的荧光基团数量以及细胞荧光的检测。
共线装置的所有激光器同时发射激光，并聚焦于同一区域，从而同时激发多种不同荧光染料。
因多种荧光信号同时发射且需要更多补偿，这种激光装置的多色组合设计灵活性较低。 共线激光装置适用于两种不同波长的激光器，用于激发几乎没有或没有重叠发射光谱的荧光染料。 比较经济的流式细胞仪可能会采用这种激光装置，以节省元件成本。
空间分离装置依次激发细胞流； 使用多种荧光基团染色的细胞依次通过各个激光束，每个检测器分别激发和检测发射光谱。 使用这类装置的优势在于：可灵活选择实验所用的染料数量； 此外，独立发射的荧光信号具有更高的灵敏度并且需要更少的补偿； 该装置在相近发射光谱中产生的荧光重叠大大减少，因此可以更容易地创建大规模多色组合。
荧光分离元件
图 11. 荧光发射。 (A)激发荧光基团在有限的波长范围内发光。 (B)有些荧光基团具有重叠的发射光谱。
激发荧光基团在有限光谱范围内发光，而不是在特定波长发光。发射荧光则需要通过光学滤光片，才能被捕获和分析。若不经过荧光分离，未过滤的多种荧光会发生重叠，导致难以分析。
图 12. 荧光分离元件。 (A)光学滤光片根据荧光波长范围分离荧光基团的发射信号。 (B)棱镜单色仪阵列将光线分到不同波长区域，并将这些区域的光聚焦到不同检测器上。
基于光学滤光片的不断开发，如今已可对使用多种荧光基团偶联抗体标记的细胞进行分析。这些光分离元件易于获取且可更换，最常用于流式细胞仪中的荧光分离。 通过组合不同的滤光片，可设计各种颜色组合，从而创建小型或大型的多色组合。这是一个经过检验的可靠系统，并具有持久耐用的元件。我们希望此类系统的滤光片易于更换，以方便不同的染料组合使用。
光谱流式细胞术与传统流式细胞术有所不同；光谱流式细胞仪利用棱镜聚焦可见光谱内的发射荧光。来自多种荧光基团的发射光会发生重叠，所以需要复杂的算法进行进一步分离。而该技术的优势在于它为有限的激光器提供了更多颜色通道。该技术仍处于开发阶段，并且某些荧光基团的计算荧光分离技术较为有限。
发射检测器
图 13. 发射检测元件。 (A)PTM捕获并放大荧光基团发射的信号。 (B)APD捕获半导体上的光子并放大信号。
来自单个细胞的发射荧光信号较弱。为方便分析，需要将发射光转换为一种可调整的数据格式。 为此，发射检测设备 捕获荧光并将光波转换为电信号； 并将独立的电信号放大，获得可供用户处理的数据。
光电倍增管（PMT）是为大多数流式细胞仪所采用的检测设备； 多个光电倍增管（PMT）排列在光路末端，可捕获每个经过滤的荧光信号。因其可以在从紫外到红外的广泛光谱范围内以线性方式捕获荧光的动态范围—非常微弱到非常明亮的信号范围，所以非常适用于多色组合实验。
其他检测设备还包括用于引导和放大发射荧光生成电子的雪崩光电二极管（APD）。对于主要基于远红外光谱内的荧光基团发射的实验， 它们可高效捕获在红外和近红外光谱区域内发射的信号。
电压设置
图 14. 电压设置。 (A)由于光电倍增管（ PMT）电压过高，使得荧光基团标记细胞的阳性发射信号不在可检测范围内并且超出刻度范围。 (B)降低电压后，可检测到阳性信号。
在流式细胞仪检测中，样品背景可能来自于细胞或样品其他成分的自发荧光。如要实现染色细胞物理特性的全面可视化，需要捕获阳性信号中的全部阴性（昏暗）信号。也就是说，需调整至理想的光电倍增管（ PMT）电压，使相关染色荧光基团与细胞的可检测（阴性）自发荧光实现最佳分离。
在运行细胞样品前，应使用荧光标准品优化流式细胞仪的光电倍增管（PMT）电压，以计算每个光电倍增管（PMT）的最佳电压。
可根据需要调整光电倍增管（PMT）电压，特别是在阳性信号过亮的情况下。调整时，用户可使用未染色的对照细胞作为背景信号的阴性对照。 而对光电倍增管（PMT）电压进行降低操作，可实现合适的阳性信号检测并降低阴性群体的强度值。
流式细胞仪检测到的荧光信号数量也会受电压设置的影响。设置更高或更低的电压，会在光电倍增管（ PMT）检测器上产生更多或更少的增益，从而实现合适的荧光信号检测。
锁定电压设置是简单流式细胞仪功能的一部分，也因此简单流式细胞仪的可检测发射荧光范围有限。调整电压设置可能比较困难，因为用户需要区分阳性细胞群体与背景。 新用户可能会设置过高或过低的电压。 为帮助这些用户，小型荧光染料组合及其相关检测器的电压会被锁定。 具有锁定设置的仪器因限制了电压设置的更改，从而可以实现工作流程的简化。
未锁定或可调整的电压设置更适用于运行多色组合实验的用户。锁定电压设置是为检测小型荧光染料组合的发射荧光而预先设定。而可调整的电压设置则不局限于一组荧光染料组合，因此适用于采用更大染料组合或更多种类染料的用户。此外，可调整的电压设置还可使用户检查阳性单染色对照，从而将其光电倍增管（PMT）信号调整至刻度范围内。作为多参数流式细胞术实验的一部分，通过调整光电倍增管（PMT）电压还可获得最佳信号补偿。
荧光补偿
图 15. 补偿。 (A)重叠发射信号可产生假阳性数据点。 (B)通过补偿数据去除了重叠的发射荧光。 补偿数据点将产生更准确的结果。
多种荧光基团的发射产生一系列可见光。从多色荧光染料组合收集得到的数据将具有重叠的荧光信号。这就可能导致阳性单标记细胞作为双阳性细胞出现。
图 16. 补偿技术。 (A)传统补偿技术采用经充分研究的系列算法组合，分析来自荧光基团、阴性设门或未染色对照的数据，从而将重叠发射光转变为单色光。 (B)混合光谱分解技术采用约束泊松回归或非负矩阵分解等算法，将重叠发射光转变为单色光。
补偿指的是利用一系列算法分离每个荧光基团的信号的过程。 传统补偿技术分离特定波长： 首先单独检测每个荧光基团，然后利用算法创建校正值矩阵； 这些校正值会用于光谱重叠，以产生独立的数值。 此过程可简单、快速得计算信号补偿。
与传统补偿技术相比，混合光谱分解技术的不同之处在于可提供单个波长的发射光光谱。
实验中的通道和荧光基团数量
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图 17. 通道。 (A) 单激光器系统可以具有多个通道。 (B)发射光发生重叠并且需要补偿。 (C)3-激光器系统配备了更多检测器，因此具有更多通道。 (D)通道增多，使得荧光基团选择增多且所需补偿减少。
捕获光电倍增管（ PMT）和雪崩光电二极管（APD）中发射光的元件被称为通道。 流式细胞仪检测到的荧光基团数由可用通道的数量决定。
单激光器系统可以具有多个通道。这意味着单激光器可激发多种荧光基团，并且检测器可捕获样品在不同波长处的发射光。 但这类实验需要复杂的补偿，因为所有荧光基团的发射光都具有重叠的波长范围。
多激光器的优势在于具有更多通道。多通道可使荧光基团选择增多，所需补偿减少，组合设计也愈加容易。 此外，还可提高实验的细胞群体分辨率。
仪器维护
流式细胞仪是一种持久耐用的精密仪器， 其大部分组件都是永久性固定装置。 定期维护和常规清洁可最大限度减少其零件更换，并且有助于获得高质量数据。
仪器清洁和维护的重要性
图 18. 因维护不当产生的常见污染物 (A)遗留物指来自之前样品的细胞或颗粒污染物。 (B)与核酸结合的染料是粘性的并且可产生背景噪音。 (C)微生物可在流式细胞仪的流体瓶和其他组件内生长。
如果不对仪器进行定期清洁，会出现以往样品材料不断累积的问题。
以往样品的遗留细胞问题是灵敏性实验的一大障碍，如检测稀有细胞； 它会使假阳性率升高。 通过在不同样品进样之间或实验结束后对管道进行冲洗，可减少先前实验遗留的细胞或颗粒数量。
定期清洁可防止荧光染料累积；某些染料（如核酸染料）更易于发生累积。 粘性染料、细胞和残骸的积聚会增加管道堵塞几率。 运行细胞培养物或组织样品的仪器更容易发生细菌污染； 其标志包括废液瓶中出现浑浊液体，以及空白样品中的事件积聚数量增加。 可根据生产说明书，使用洗涤液或漂洗液冲洗整个系统，防止微生物生长。
常规清洁
图 19. 每日清洁。 (A)在不同样品进样之间，使用漂洗液和去离子水冲洗管道。 部分仪器可以自动进行清洁。 (B)启动和每日关机清洁程序有助于防止染料和细胞遗留物的累积。 (C)其他日常维护检查涉及由软件引导的自动化清洁方案。
通过清洁可最大限度减少样品间污染。 不同用户进行实验之间，大多数制造商都会建议用户在运行下一个实验之前依次使用10%漂洗液和去离子水冲洗管道。 部分仪器可在不同样品进样之间进行自动清洁。
大部分系统需要在使用前和每日工作结束时使用去离子水和洗涤液进行冲洗，以去除流式细胞仪管道和流动池中的细胞和染料。 有关启动和关机清洁方案详细介绍，多见于用户手册。 日常维护有助于确保流体管道和流动池不含微生物或以往样品污染物。
部分流式细胞仪还有其他每日维护要求，包括液体池处理、检查困在过滤器中的气泡以及排空废液箱。 部分流式细胞仪还具有由软件引导的自动化清洁方案。 该等自动化系统通过删减某些任务，如气泡检查或关机程序，可减少用户工作量。 总之，这些方案都可节省时间并实现合理的清洁。
流体净化
图 20. 流体系统维护。 (A–F)清洁或更换流式细胞仪零件，以维护正常仪器性能并最大限度减少遗留物、背景噪音和微生物污染。
通过结合流体冲洗、鞘液过滤器更换和深度仪器清洁，可去除遗留物、荧光染料和微生物。 大部分流式细胞仪需要每2周至每月对鞘液管、废液管、流体容器和流动池进行一次深度清洁， 以防止残骸累积并清除生物危害性材料和微生物。
根据流体系统的类型，确定是否需要取出和更换或清洁组件。 蠕动泵系统需要每6个月至每年取出和更换一次导管。 若不更换，污染物或残骸则会在事件收集过程中不断积累。 压力系统需要定期维护喷嘴及相关零件，以便样品能够快速进入流式细胞仪。 注射泵系统还需要清洁注射器，以减少污染细胞。 注意遵循用户手册和日志维护，以确保数据的完整性。
对比技术规格文档
技术规格表的用途
流式细胞仪制造商提供的技术规格表（技术规格或规格表）描述了仪器的主要性能特点，可为想要购买流式细胞仪的用户提供大量信息。 然而，尽管采用相同的术语，但不同技术规格表因使用的数值计算方法不同，亦会难以对比。
技术规格表可助您了解流式细胞仪的设计属性，如性能、尺寸大小、环境和软件，从而确定仪器是否适合您的研究。
对比多家制造商的仪器规格
Technical specifications can be used as a basis for comparison, helping you assess the value of different instruments for the price. The spec sheet is also a guide to the performance that the manufacturer will warrant. For this reason, you should have a good understanding of the stated values and how they pertain to your intended use of the instrument. When using the spec sheet as a comparison guide across platforms, be inquisitive. There are many performance values that appear comparable across instruments but in reality are quite different. A specification is derived from a specific test or calculation, but these tests are not standardized across instrument developers and may be misleading in a side-by-side comparison.
Comparing various tech specs can be challenging because their values may have been calculated in different ways, despite sharing the same terminology. This white paper provides helpful hints about how to decipher the variations.
技术规格可作为对比的基础，助您评估不同仪器的定价和价值。 技术规格表还可助您了解制造商所保证的仪器性能。 因此，您可充分了解仪器标明的价值以及是否符合您的预期用途。 在使用技术规格表作为仪器对比指南时，应进行全面彻底的了解。 不同仪器间，许多性能值看似接近，实际却大有不同。 规格数值均来自于特定的测试或计算，但是不同仪器开发商采用的测试方法并不相同，因此可能导致错误的横向对比。
不同制造商提供的技术规格表分节也可能大不相同，这也进一步增加了差异性。 图1-8以 Invitrogen Attune NxT流式细胞仪的技术规格表为例，描述了常见的发布信息分类。 该表讨论了在流式细胞仪评估期间需要特别注意的主要规格，包括关于如何破解差异的实用技巧。
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图 1. 流体系统。 流式细胞仪的流体系统将样品管中的样品输送至流动池。 样品通过流动池（并通过激光和检测器）后，则被运送到废液中。 技术规格表中的流体系统部分提供了关于样品、体积、流速、流动池和流体容量的信息。
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图 2. 光学系统。 作为分析平台，流式细胞术依赖于激光对单个细胞的检测以及对产生荧光和散射光的信号收集。 光学元件可处理仪器内的光照和光线收集。 技术规格表中的光学系统部分概述了光学系统规格，如激光器类型和功率、激光分布、激光对准和光电倍增管（PMT）。
特别注意：激光功率
单位为mW
功率规格常被定义为由激光制造商发布的激光输出量（图2）。 但是，标明的功率规格并不一定与检测点的实际输出功率相一致、相对应，因为光线在激光器和流动池之间的光学元件内损失可能很大。 而且不同系统的光损失也各不相同。 高度光损失表示部分激光功率未在实验中未被充分利用；光损失减少表示流动池的激光强度增加，导致荧光基团的激发增强和灵敏度升高。 由于存在这些差异性，所以即使技术规格表上激光功率数值较高，也并不代表该仪器比其他仪器更灵敏。
如何对比
在对比仪器时，应谨慎对待这些规格数值。 大部分制造商不会报告到达流动池时的实际功率，但要知道这正是需要对比之处。
特别注意：针孔和激光对准设计
此规格（并非每个制造商都会报告）是指决定是否每个激光器生成的荧光信号均在检测器（也称PMT）上被分离的针孔数量。 选择时，您需了解激光器是根据内部针孔呈空间分离式排列还是共线排列。 针孔可实现荧光基团的最大激发并将激光光线交叉干扰降至最低。 许多流式细胞仪制造商采用共线激光装置。 当激光器以共线形式对准通过单个针孔，来自多个激光器的信号则共用同一条光路。 这种配置意味着，由不同激光器激发的多种染料的信号将被同一个检测器检测，而这会影响补偿值并导致分析困难。 此外，其还存在对对准问题敏感（如果光束未完全共线，会增加重合率）或对昏暗标记灵敏度低的问题。 另一种可选设计为空间分离系统(图2)。 这种配置具有多种优势，包括无对准问题、具有更多激光颜色选择以及改善的多色组合补偿。
如何对比
务必了解每个针孔对应的激光器类型和数量，并确定系统采用的是空间分离亦或共线激光器。
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图 3. 性能。 在制造商广泛发布的标准规格中，技术规格表的性能部分包含几种常见特性，如MESF计算、数据采集速率以及前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数。
特别注意：最大事件率或理论最大事件率
单位为事件数/秒
事件率是指通过仪器检测点的细胞或颗粒的实际数量。 有两种几乎完全不同的方法可用于确定该数值，通常都采用相同的单位表示（即，事件数/秒）。 这两种事件率计算方法为：
- 评估电子元件处理事件的最高速度
- 评估达到指定重合率时的最大事件率
了解制造商如何计算技术规格表中的该数值十分重要！
方法1
此方法为理论意义上的方法，它忽略了重合率以及其他仪器设计特点，如系统流体学。 因此，尽管电子元件能够以 10,000–100,000事件数/秒的速度处理事件，但根据泊松分布，该事件率对应的重合率可能远远超过普遍接受的10%速率极限。 近年来，随着更快速（但不一定是更高质量的）电子电路的出现，这种事件率规格计算方式正日益受到认可；但注意，这种事件率计算方式未将重合事件考虑在内。
方法2
此种仪器事件率计算方法是基于重合率的10%水平，这对研究人员来说更有意义(图3)。 重合率越低，表示数据完整度越高。 因此，使用这种方法最能代表可用于生成高质量数据的实际事件率对应的可接受重合率。 若制造商使用该方法计算事件率规格，则用户可以更加确信数据在指定事件率对应的可接受重合率水平范围内。
如何对比
在对比仪器时，您应确保了解制造商采用何种方法计算事件率规格数值。 制造商如使用第一种方法（电子元件处理速度）进行计算，您需在运行样品时仔细检查重合率。
特别注意：遗留率
遗留率是指遗留并污染下一个样品的原始样品量，样品遗留将导致数据不准确(图3)。 遗留率的测量方法通常是先获取样品的固定体积，再获取无颗粒缓冲液（如，磷酸盐缓冲生理盐水（PBS））的固定体积。 随后，鉴别缓冲液中代表污染细胞的事件。 许多制造商通过运行特定细胞系或磁珠，确定指定条件下的遗留率数值。
如何对比
了解具体的指定条件以及使用哪种样品确定遗留率数值十分重要。 例如，规格测试所用的洗涤次数或者颗粒或细胞的大小或类型，可能与研究人员所用的完全不同。 咨询制造商如何计算其遗留率数值。 了解不同制造商使用的不同计算方法，可助您根据规格数值直接对比遗留率。
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图 4. 软件。 技术规格表的软件部分可使研究人员了解系统内置软件的功能和特点。 该部分还对功能范围、用户定义功能、维护特点以及用户账户管理进行了说明。 不同制造商生产的仪器具有不同的软件特点，有些系统配有独特的专有功能选项。
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图 5. 质量和监管。 质量和监管规格是指制造完整性、保修、现场安装工程程序和ISO认证。
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图 6. 数据管理。 数据管理部分对于成功的计算机安装和设置至关重要。 这一部分详述了RAM、硬盘驱动和FSC格式等规格。
特别注意：操作温度
单位为°C或°F
该规格常被忽视，但对仪器的终身使用价值非常重要，因为光学对准和流体学与这些数值都密切相关(图7)。
如何对比
确定实验室是否处于相对恒定的温度以及仪器是否会在不同地方使用。 仪器性能仅在规定温度范围内经过测试且具有保证，因此，一定要注意操作条件。
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图 7. 安装要求。 标准要求部分描述了仪器的环境影响、操作条件和占地等信息。
特别注意：尺寸和重量
高 x 宽x 深，单位为厘米（cm）或英寸（in.）；仪器重量单位为千克（kg）或磅（lb）
考虑仪器是否能够放置在通风橱内的预定空间或区域内。 务必考虑自动采样器等配件的空间要求，并了解流体系统是否需要空间(图7)。 许多流式细胞仪都具有外部流体系统，这大大增加了仪器所需的整体空间。 如果仪器需要定期转移，应考虑其困难性。 应注意，并非所有台式仪器都具有相同的空间需求或可转移性。
如何对比
在演示时，应要求查看已安装所有组件的完整系统，从而可以直接对比每个系统所需的空间。
特别注意：样品板分析速度
单位为分钟/96或384孔板
样品板分析速度通常是指完整分析一个96或384孔板所需的时间(图8)。 该定义包含两方面内容：一、样品体积；二、样品处理速度。 应注意，该规格中报告的时间值越低，可能代表数据质量的损失越大。 同时，务必明确在计算该数值时所用的分析样品体积以及样品处理速度。 有些制造商展示的是通过收集小体积样品而最大限度减少样品板处理时间的规格图。 但这种操作实际上需要高度浓缩的样品，并会导致产生数据质量问题，如较高的重合率和中断率。 反之如果样品浓度不足，则小体积进样可能导致事件数过少而不具有统计学意义。
样品处理速度（样品进入流体系统的速度）还会影响数据质量。 在采用流体动力学聚焦技术的流式细胞仪中，当流速增加时样品轴流会变宽并会造成细胞更广的分布（图2）。 样品处理速度升高，将导致变异性增大、检测精确度降低以及数据质量降低。 在采用声波辅助流体动力学聚焦技术的仪器中，细胞紧密排列在细胞流的中心，不受样品处理速度的影响，所以信号变异性更低，数据质量更高。 因此，如果您选择通过提高样品输入速度来缩短样品板处理时间，您应使用采用声波聚焦技术的仪器，以避免数据质量降低。
样品板分析速度的另一个影响因素是在不同样品进样之间是否冲洗探针的问题。 冲洗探针会延迟样品板分析时间，但不冲洗探针可能会增加残留率—这是在指定规格条件下运行实验前需要考虑的一个因素。
如何对比
务必了解达到制造商技术规格表所述时间可能产生的数据质量损失。
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图 8. 采样器规格。 采样设备是流式细胞仪的配件。 其规格包括采集时间、遗留率和混合方法。 其他信息还可能包括兼容的样品板类型以及流体系统选择。
结论
务必咨询与指定规格数值相关的测试，从而确保您准确对比了仪器的性能。
相关资源
了解流式细胞术。 这些资源将帮助您进一步理解流式细胞术的基本知识和科学原理，扩展您的特殊应用和技术能力。
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。