多色流式细胞分析实验需使用正确的荧光染料组合
流式细胞分析试剂和仪器的进步，使得研究人员能够开展日益复杂的多色实验。 多色流式细胞术的优势在于能够使用多个标记物进行单细胞研究，能够使用多个分析物使细胞数据相关联，并最终获得更准确界定的细胞群体（图1）。 此外，多色实验可通过减少样品和样品体积需求量并提高样品通量，进而提高效率。 注意，尽管增加颜色和检测抗原的数量可提高实验设计的复杂度，但这需要对优化、对照和其他细节进行格外要求[1]。
对于多色流式细胞术，其中最大的一项挑战就是选择合适的荧光染料和抗体组合，从而最大限度减少对补偿和重叠调整的需求，同时保证数据质量和准确度不受影响。 我们在此提供了非常适合初学者学习的优质资源，例如来自斯坦福大学Holden Maecker博士的 Molecular Probes流式细胞术网络讲座 “多色流式细胞术组合方案设计”， 以及其他相关出版物 [2–4]。
在设计多色流式方案时，应考虑以下几个关键要素：
- 提前了解所用仪器的配置（激光和滤光片）。
- 使用如Molecular Probes荧光光谱查看器等相关工具，查看荧光染料的光谱重叠。
- 滴定和优化每种抗体；组合方案需反复优化，以构建正确的方案。
- 对低丰度抗原使用明亮的荧光染料标记抗体，对高表达抗原使用弱的荧光染料标记抗体。
- 使用对不同细胞亚群具有光谱相似性的荧光染料，这些不同的细胞亚群将分别设门和分析。
- 多色方案应包含细胞活性染料，用于从数据中排除死细胞和残骸。
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图 1. 使用Attune NxT声波聚焦流式细胞仪对人外周血单核细胞（PBMC）进行10色免疫分型。 根据前向散射和侧向散射图为淋巴细胞和单细胞设门 (A)。 在淋巴细胞门内，可根据CD3的表达分离T细胞 (B)，并进一步将其细分为CD4+和CD8+亚群 (C)。 此外，调节性T细胞可表达CD4和CD25 (G)，是主要外周耐受的重要媒介。 根据CD62L的表达可区分初始CD4+和CD8+ T细胞（TN），而HLA-DR由活化T细胞（TA） (D,H)表达。 常规突状细胞存在于外周血中，通常对T和B细胞谱系标记呈阴性，并且共同表达整合素CD11c和HLA-DR (F)。 在散射图中，单核细胞恰好位于淋巴细胞上方 (A)，并且表达CD14和CD33 (E)。
确定荧光染料亮度
在流式细胞分析中，荧光染料亮度不仅受荧光染料本身量子产率和消光系数的影响，也受背景亮度的影响。 背景荧光，例如来自于非特异性染色、细胞自体荧光和仪器噪音等的背景荧光，可影响对抗体偶联染色细胞群体（阳性）和未染色细胞群体（阴性）的荧光的分辨能力。
信噪比（S/N）是衡量测定的灵敏度以及测定对染色和未染色群体差异的检测能力的一个指标； 可通过采用阳性细胞的中值荧光强度（MFI）除以阴性细胞的中值荧光强度（图2），进行简单计算。
但是，荧光染料抗体的相对亮度不仅由染色与未染色细胞的强度差异决定，还由未染色细胞群体的强度分布扩散程度决定。 Maecker等人认为 [2]，计算染色指数（SI）时应将这两种参数包含在内（图2）。 染色指数（SI）可用于对比使用相同抗体的不同荧光偶联物染色的细胞群体的柱状图（表1，图3）。
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图 2. 染色指数（SI）和信噪比（S/N）的比较。 图中两种荧光染料的信噪比（S/N）相同，但染色指数（SI）不同，这是因为它们具有不同宽度的负峰（窄W1和宽W2）。 负峰的宽度可影响阳性和阴性信号的分离，因此，染色指数（SI）是对比荧光染料亮度的首选统计指标。
表 1. CD4抗体（克隆53.5）的不同荧光染料的染色指数。
| 亮度 | 偶联物的荧光染料成分（偶联物货 号） | 最大激发波长* | 最大发射波长* | 激光谱线 | 带通发射滤光片（BP Em filter）† | 染色指数 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 高 | APC (MHCD0405) | 645 | 660 | 633 | 660/20 | 200.31 |
| PE (MHCD0404) | 496, 565 | 575 | 488 | 585/42 | 158.46 | |
| APC-Cy5.5 (MHCD0419) | 650 | 690 | 633 | 710/50 | 108.97 | |
| PE-Cy5.5 (MHCD0418) | 496, 565 | 690 | 488 | 695/40 | 105.91 | |
| Alexa Fluor 488染料(MHCD0420) | 495 | 519 | 488 | 525/50 | 91.72 | |
| 中等 | PE–Alexa Fluor 610染料(MHCD0422) | 488 | 628 | 488 | 620/10 | 70.71 |
| FITC 染料 (MHCD0401) | 493 | 525 | 488 | 525/50 | 56.40 | |
| PE-Cy7 (MHCD0412) | 496, 565 | 774 | 488 | 780/60 | 53.70 | |
| PE–Alexa Fluor 700染料(MHCD0424) | 496, 565 | 723 | 488 | 720/30 | 52.45 | |
| TRI-COLOR染料(PE-Cy5) (MHCD0406) | 496, 565 | 670 | 488 | 695/40 | 50.31 | |
| PE–Texas Red染料(MHCD0417) | 496, 565 | 613 | 488 | 695/40 | 40.85 | |
| Qdot 605 纳米晶体 (Q10008) | 350 | 605 | 405 | 605/20 | 35.17 | |
| APC–Alexa Fluor 750 染料(MHCD0427) | 645 | 775 | 633 | 780/60 | 31.91 | |
| Alexa Fluor 700 染料(MHCD0429) | 696 | 719 | 633 | 710/50 | 24.85 | |
| 低 | Qdot 655 纳米晶体 (Q10007) | 350 | 655 | 405 | 655/20 | 20.62 |
| Qdot 705纳米晶体(Q10060) | 350 | 720 | 405 | 720/20 | 18.38 | |
| Pacific Blue 染料(MHCD0428) | 410 | 455 | 405 | 450/50 | 14.61 | |
| Alexa Fluor 405染料(MHCD0426) | 401 | 421 | 405 | 450/50 | 10.01 | |
| PerCP (MHCD0431) | 482 | 675 | 488 | 695/40 | 8.75 | |
| Pacific Orange 染料(MHCD0430) | 400 | 551 | 405 | 585/42 | 6.06 | |
| *偶联物的近似最大荧光激发(Ex)和发射(Em)波长，单位为nm。 †BP Em filter =带通发射滤光片，单位为nm。 使用BD™ LSR II流式细胞仪和FACSDiva™ 软件6.1版确定染色指数。 | ||||||
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图 3. CD4抗体偶联物染色细胞的代表性柱状图。 使用由氯化铵裂解的人全血样品评估20种不同小鼠抗人CD4抗体直接偶联物的性能（见表1）。 对每种偶联物进行滴定和优化，以获得最大信噪比。 使用BD™ LSR II流式细胞仪和FACSDiva™ 软件6.1版分析细胞。 柱状图代表在淋巴细胞门中收集的10,000个细胞： (A) 来自于 CD4抗体-APC偶联物的高亮度；(B) 来自于 CD4抗体- PE–Alexa Fluor 700偶联物的中等亮度；(C) 来自于 CD4抗体- Pacific Blue偶联物的低亮度。 图片左角列出了每种偶联物的染色指数（SI）。
在线工具： 荧光光谱查看器和流式多色方案设计工具
在线工具Molecular Probes荧光光谱查看器可展示荧光染料和荧光蛋白的激发和发射光谱，有助于为您的多色实验选择合适的染料。 您可输入您的仪器激光和滤光片配置（图4），然后选择感兴趣的荧光染料。 图5为您展示了一种五色组合方案实例。 此外，荧光光谱查看器还具有重叠表功能，您可通过该表查看每个通道内每种染料的荧光重叠（表2）。 如需使用荧光光谱查看器，请访问 thermofisher.com/spectraviewer。
只需简单四步，我们的新型组合方案设计工具即可为您的流式实验选择合适的荧光抗体： 1)访问 thermofisher.com/flowpanel，2) 选择抗体种属反应性，3)选择最多14种靶标（包含细胞活性染料），4) 选择您需要的激光或荧光染料（图6A）。 将在每个激光的选项卡显示与靶标匹配的抗体和染料，您也可以通过滚动下拉页面查找激光列表。 将在每个单元格显示可用的产品数量；只需点击数字，从弹出窗口的列表中选择所需产品。 随后，您的组合选择将会显示在表的顶端（图6B）。 当您完成挑选产品后，打印列表或通过电子邮件分享。
图 4. Molecular Probes荧光光谱查看器组成概览。 相同荧光染料的(A)激发光谱和(B)发射光谱。 (C)激光激发波长。 (D)带通发射滤光片波长。
图 5. Molecular Probes荧光光谱查看器显示的五色组合。 由405 nm 激光激发的Pacific Blue染料（紫色）、由405 nm 激光激发的LIVE/DEAD可固定死亡细胞黄色染色剂（黄色）、由488 nm激光激发的R-藻红蛋白（PE，橙色）、由561 nm激光激发的Alexa Fluor 647– PE（红色）以及由633 nm激光激发的Alexa Fluor 750–别藻蓝蛋白（棕色）的发射曲线。 所示激光为405 nm（紫色）、488 nm（蓝色）、561 nm（黄色）和633 nm（红色）。
表 2. 五种荧光染料的荧光光谱查看器重叠表（图5）和Attune NxT流式细胞仪的发射滤光片配置。
| 荧光基团 | 带通（BP）发射滤光片（nm） | |||
|---|---|---|---|---|
| 440/50 | 574/26 | 670/14 | 780/60 | |
| Pacific Blue 染料 | 48.2% | 0.9% | 0.0% | 0.0% |
| LIVE/DEAD可固定死亡细胞黄色染色剂 | 0.2% | 20.3% | 2.2% | 0.0% |
| PE（R-藻红蛋白） | 0.0% | 53.7% | 1.2% | 0.0% |
| Alexa Fluor 647–PE | 0.0% | 3.3% | 28.9% | 0.1% |
| Alexa Fluor 750–别藻蓝蛋白 | 0.0% | 0.0% | 2.9% | 66.1% |
| 百分比代表使用指定发射滤光片（与激发光源无关）检测得到的相对荧光信号。 574/26 nm带通滤光片分别收集20.3%的LIVE/DEAD可固定细胞死活黄色染色剂荧光和53.7%的PE荧光染料荧光。 但，它们的荧光光谱实际上并无重叠，因为LIVE/DEAD染色剂在405 nm处激发而非488 nm，PE在488 nm处激发而非405 nm；即，它们是被不同激光激发的。 | ||||
图 6. 新型多色方案设计工具屏幕截图。
参考文献
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。