介绍

诱导多能干细胞 (iPSC) 是一种基因重编程的成体细胞，表现出与胚胎干细胞相似的多能干细胞样状态（Meissner 等人，2007；Park 等人，2008；Takahashi 等人，2007；Takahashi 与 Yamanaka；2006；Wernig 等人，2007；Yu 等人，2007）。虽然这些人工生成的细胞在人体中并不存在，但它们表现出与胚胎干细胞 (ESC) 非常相似的特性；因此，它们是用于药物发现、细胞治疗和基础研究的多能细胞的宝贵新来源。

生成 iPSC 的方法有很多种，包括逆转录酶病毒介导的基因转导和化学诱导。逆转录病毒载体需要整合到宿主染色体中才能表达重编程基因，而基于 DNA 的载体（如腺病毒、腺相关病毒）和质粒载体以游离形式存在，不需要整合；然而，它们仍可能以一定频率整合到宿主染色体中。与这些载体不同，CytoTune 重编程载体不会整合到宿主基因组中或改变宿主细胞的遗传信息（Fusaki 等人，2009；Li 等人，2000；Seki 等人，2010）。

CytoTune-iPS 仙台病毒重编程系统利用基于在感受态仙台病毒 (SeV) 中进行复制的载体，安全高效地递送和表达将体细胞重编程为 iPSC 所必需的关键遗传因子。与依赖于整合到宿主细胞基因组中的病毒载体的许多可用实验方案不同，CytoTune 重编程系统使用非整合且保留在细胞质中的载体（即，它们不占用空间）。此外，利用 SeV 的细胞质性质和引入关键病毒蛋白中的功能性温度敏感性突变，可以清除宿主细胞的载体和重编程因子基因。

CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒含有四种基于 SeV 的重编程载体，每种载体都能表达四种山中因子（即，Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）中的一种，并针对从人体细胞中生成 iPSC 进行了优化。本试剂盒中的重编程载体设计用于提高生物和环境安全性。

需要的材料

  • CytoTune 仙台病毒重编程载体（货号 A1378001）
    注：为确保成功进行重编程，您需要全部四种重编程载体。
  • 要重编程的外周血单核细胞 (PBMC)（AllCells，货号 PB003F）
    注：您也可以使用通过传统方法（即 Ficoll-Paque 纯化）从血液中提取的 PBMC，
    而不是使用冷冻的 PBMC。
  • StemPro-34 SFM (1X)，液体（货号 10639-011）
  • L-谷氨酰胺（货号 25030）
  • 重组人 SCF（c-kit 配体）（货号 PHC2111）
  • 重组人 FLT-3 配体（货号 PHC9414）
  • 重组人促血小板生成素 (TPO)（货号 PHC9514）
  • 重组人 IL-6（货号 PHC0065）
  • Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照）（货号 S1520-100）
  • 可选：人新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株；ATCC 编号 CRL2522），作为阳性
    重编程对照
  • 含 GlutaMAX-I 的 DMEM（高糖）（货号 10569-010）
  • KnockOut DMEM/F-12（货号 12660-012）
  • 经 ES 细胞验证的胎牛血清 (FBS)（货号 16141-079）
  • KnockOut 血清替代物 (KSR)（货号 10828-028）
  • MEM 非必需氨基酸 (NEAA)（货号 11140-050）
  • GlutaMAX-I 添加剂（货号 35050-061）
  • 重组人碱性 FGF（货号 PHG0264）
  • 2-巯基乙醇，1000X（货号 21985-023）
  • 青霉素-链霉素，液体（货号 15140-122）
  • 聚凝胺（Sigma，货号 H9268）
  • 附着因子（货号 S-006-100）
  • TrypLE Select 细胞解离试剂（货号 12563）或 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（货号 25300）
  • 不含钙、镁离子的 DPBS（货号 14190-144）
  • TRIzol LS 试剂（货号 10296-010）
  • SuperScript VILO cDNA 合成试剂盒（货号 11754-050）
  • AccuPrime SuperMix I（货号 12342-010）
  • 小鼠抗 Tra1-60 抗体（货号 41-1000）
  • 小鼠抗 Tra1-81 抗体（货号 41-1100）
  • 小鼠抗 SSEA4 抗体（货号 41-4000）
  • 兔抗-SeV 抗体（MBL International Corporation，沃本，马萨诸塞州；货号 PD029）
  • Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（货号 A11029）
  • Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（货号 A11032）
  • Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体（货号 A11034）
  • Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体（货号 A11037）
  • 配备体视显微镜的无菌细胞培养通风橱（即生物安全柜）
  • 倒置显微镜
  • 设置为 37°C、5% CO2 的培养箱
  • 设置为 37°C 的水浴
  • 无菌血清移液器（5 mL、10 mL）
  • 离心机
  • 15 mL 离心管
  • 60 mm 和 100 mm 经组织培养处理的培养皿
  • 经组织培养处理的6孔培养板
  • 25号 1½ 英寸针头

重编程指南

  • 为保持无菌培养条件，所有步骤均采用无菌实验室规范在层流罩下进行。
  • 您可以使用 CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒对处于增殖和静止状态的多种细胞类型进行重编程。然而，不同细胞类型之间的重编程效率可能有所不同 (~0.01%–1%)。
  • 为确保成功进行重编程，使用全部四种重编程载体转导您的细胞。
    注：为确保成功进行重编程，需要在您的宿主细胞中表达全部四种山中因子（即，Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）。
  • 每个含4支试管的 CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒均提供足够在6孔板的2个孔中（5 × 105 个细胞/孔）转导细胞 (MOI = 3) 的充足试剂。
  • 各 CytoTune 仙台病毒重编程载体的滴度因批次而异。对于您的载体的具体滴度，请参考我们网站上提供的分析证书 (CoA)。
  • 病毒滴度会随着每次冻融循环而显著降低。请避免对重编程载体进行反复冻融。重新冷冻或解冻的试剂盒无法保证病毒滴度。
  • 在开始之前，确保培养基已平衡至 37°C，并进行适当的气体平衡。
  • 对于阳性对照，我们建议使用人新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株；ATCC 编号 CRL2522）进行重编程实验。请注意，不同靶细胞的实验条件可能不同，需要针对每种细胞类型进行优化。以下实验方案中给出的示例不能保证所有细胞类型均能产生 iPSC。
  • 有关常见问题的完整列表，请参见我们的 CytoTune-iPS 仙台病毒重编程试剂盒常见问题解答。

制备培养基

10 μg/mL bFGF 溶液 (1000 μL)

  1. 要制备 1 mL 10 μg/mL bFGF 溶液，请在无菌条件下混合下列组分：
    组分用量
    bFGF10 μg
    不含钙、镁离子的 DPBS980 μL
    10% KSR10 μL
  2. 分装，在 –20°C 条件下最长可储存6个月。

SCF（c-kit 配体）、FLT-3 配体、促血小板生成素 (TPO) 和 IL-6 储备液

SCF（c-kit 配体）、FLT-3 配体、促血小板生成素 (TPO) 和 IL-6 均以冻干形式提供。按照
其特定产品说明书中的描述制备储备液。

1 mg/mL IV 型胶原酶溶液

  1. 向 IV 型胶原酶中加入 DMEM/F-12，以制备 10 mg/mL 储备液。轻轻涡旋，使溶液混悬并对溶液进行过滤灭菌。可分装此溶液并在 –20°C 条件下冷冻，直至使用。
  2. 在 DMEM/F-12 中制备 1 mg/mL IV 型胶原酶工作溶液。如果在 2–8°C 下适当储存（分装储存，以避免重复加热），该工作溶液可使用2周。

MEF/成纤维细胞培养基（用于制备 100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL MEF/成纤维细胞完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
    组分用量
    DMEM89 mL
    经 ESC 验证的 FBS10 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
  2. MEF 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长1周。

PBMC 培养基（用于制备 500 mL 完全培养基）

PBMC 培养基由添加适当细胞因子的 StemPro-34 完全培养基组成。按以下步骤制备 500 mL PBMC 完全培养基。

  1. 将冷冻的 StemPro-34 营养添加剂在 4°C 下过夜解冻。
  2. 解冻后，轻轻翻转样品瓶数次，充分混匀添加剂，然后在无菌条件下将样品瓶的全部内容物转移至 StemPro-34 SFM 瓶中。涡旋该瓶以混合并获得均匀的完全培养基。
  3. 在无菌条件下加入 L-谷氨酰胺至最终浓度 2 mM（将 5 mL 200 mM L-谷氨酰胺加至 500 mL 培养基中）。
  4. 添加以下生长因子至指定的最终浓度：
    细胞因子最终浓度
    SCF100 ng/mL
    FLT-3100 ng/mL
    TPO20 ng/mL
    IL610 ng/mL
  5. 完全培养基在 2–8°C 条件下避光保存时的有效期为30天。

人 iPSC 培养基（用于制备 100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL 人 iPSC 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：
    组分用量
    KnockOut DMEM/F-1278 mL
    KnockOut 血清替代物20 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
    GlutaMAX-I 添加剂1 mL
    2-巯基乙醇，1000X100 μL
    青霉素-链霉素（可选）1 mL
    bFGF (10 μg/mL)*40 μL
    * 制备不含 bFGF 的 iPSC 培养基，然后在使用培养基时添加新鲜的 bFGF。
  2. 人 iPSC 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长4周。

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制备 MEF 培养皿

明胶包被培养容器

  1. 用附着因子 (AF) 溶液覆盖每个新培养容器的整个表面，并将容器在 37°C 下孵育30分钟或在室温下孵育1小时。
  2. 在层流培养罩中采用无菌操作，临用前通过抽吸完全去除培养容器中的 AF 溶液。包被容器可立即使用或包裹在 Parafilm 封口膜中在室温下储存不超过24小时。在加入细胞或培养基之前，无需洗涤培养表面。

解冻 Gibco MEF（经辐照）

  1. 从液氮储存罐中取出含有失活 MEF 的冻存管。
  2. 用双手轻轻滚动冻存管除霜，并在 37°C 水浴中轻轻涡旋。
  3. 当冻存管中仅残留一小块冰晶时，将其从水浴中取出。用 70% 乙醇喷洒冻存管外部，再将其置于细胞培养通风橱中。
  4. 使用移液管将解冻的细胞轻轻移至 15 mL 锥形管中。
  5. 使用 1 mL 预热 MEF 培养基冲洗冻存管。将培养基转移到含有细胞的同一 15 mL 锥形管中。
  6. 向细胞中逐滴加入 4 mL 预热的 MEF 培养基。轻轻上下吹吸以混匀。
    注：缓慢添加培养基有助于避免细胞出现渗透压休克。
  7. 以 200 × g 离心细胞5分钟。
  8. 吸出上清液，并将细胞沉淀重悬于 5 mL 预热的 MEF 培养基中。
  9. 取出 20 μL 细胞悬液，采用您选择的方法（如 Countess 自动细胞计数仪）进行活细胞计数。

MEF 铺板

  1. 在室温下以 200 × g 离心剩余细胞悬液（解冻 Gibco MEF 步骤9）5分钟。
  2. 吸出上清液。将细胞沉淀重悬于 MEF 培养基中，使细胞密度达到 2.5 × 106 个细胞/mL。
  3. 从明胶包被培养容器中吸出明胶溶液。
  4. 将适量的 MEF 培养基加入到每个培养容器中（请参见下表1）。
  5. 在这些培养容器中，加入适量的 MEF 悬液（参见下表1）。
    注：Gibco 小鼠胚胎成纤维细胞（经辐照）的推荐铺板密度为 2.5 × 104 个细胞/cm2。
  6. 前后左右快速移动培养容器数次，使细胞分散
    于容器表面。
  7. 将细胞在 37°C、含 5% CO2 潮湿空气的培养箱中孵育。
  8. 在铺板后 3-4 天内使用 MEF 培养容器。


表1.失活 MEF 的所需用量

容器尺寸生长面积培养基的用量MEF 的数量MEF 悬液的用量
96孔板0.32 cm2/孔0.1 mL1.0 × 104/孔4 μL
24孔板2 cm2/孔0.5 mL5.0 × 104/孔20 μL
12孔板3.8 cm2/孔1 mL1.0 × 105/孔40 μL
6孔板9.6 cm2/孔2 mL2.5 × 105/孔0.1 mL
60 mm 培养皿19.5 cm25 mL5.0 × 1050.2 mL
100 mm 培养皿58.95 cm210 mL1.5 × 1060.6 mL
25 cm2 培养瓶25 cm25 mL6.3 × 1050.25 mL
75 cm2 培养瓶75 cm215 mL1.9 × 1060.75 mL
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重编程 PBMC

以下实验方案已针对外周血单核细胞 (PBMC)（AllCells，货号 PB003F）进行优化。我们建议您针对您的细胞类型优化实验方案。

       第 -4 天：接种 PBMC

  1. 转导前4天，解冻 PBMC 并将细胞轻轻转移至24孔培养板的一个孔中。向细胞中加入 1 mL StemPro-34 培养基，同时轻轻搅拌混匀。注：我们建议使用24孔板中间部分的孔，以防止孵育过程中培养基过度蒸发。
    注：您也可以使用传统方法从血液中提取 PBMC（即，Ficoll-Paque 纯化），而不是使用冷冻 PBMC。
  2. 将细胞悬液以 200 × g 离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于 1 mL PBMC 完全培养基（含适当细胞因子的 StemPro-34 完全培养基；分装细胞因子并每天新鲜加入）中，使浓度达到500,000个细胞/mL。
  3. 将细胞放入 37°C、5% CO2 培养箱内并孵育过夜。

    第 -3 天至第 -1 天：观察细胞并加入新鲜培养基。

  4. 轻轻进行细胞计数，去除 0.5 mL 培养基，加入 0.5 mL 新鲜的 PBMC 完全培养基，不要扰动细胞。
    注：细胞不会增殖，但应在最初几天内维持稳定的细胞数量（PBMC 含有多种细胞，目前的培养基系统只针对小细胞群）。

    第0天：进行细胞计数并进行转导

  5. 使用血细胞计数器或 Countess 自动细胞计数仪进行细胞计数，以确定细胞活力和总数量。
    注：细胞数量可能减少。使用活细胞计数继续进行转导。
  6. 收获细胞并以 2.5 × 105–5 × 105 个细胞/孔接种24孔板的孔以进行转导。
  7. 从 –80°C 的储存设备中取出一组 CytoTune 仙台病毒试管。首先将试管底部浸入 37°C 水浴中 5–10 秒钟，然后将试管从水浴中取出，让其在室温下解冻，每次解冻一支试管。解冻后快速离心试管并立即将其置于冰上。
  8. 通过添加四管 CytoTune 仙台病毒 (MOI = 6) 及 <0.3 mL 体积的 4 μg/mL 聚凝胺并在 37°C 下孵育过夜，进行细胞转导。
    注：我们建议先按照 MOI=6 进行转导。如果您获得较高的转导效率，可将 MOI 值降为3。

    第1天：去除 CytoTune 仙台病毒并培养细胞。

  9. 第二天，从培养板中取出细胞和培养基，然后转移至 15 mL 离心管中。
  10. 将细胞以 400 × g 离心10分钟，吸出上清液然后将细胞重悬于24孔板内 0.5 mL PBMC 完全培养基中，以此去除 CytoTune 仙台病毒。
    注：细胞可能会大幅死亡 (>60%)；使用活细胞计数继续实验方案。在最初的48小时，在显微镜下观察细胞，如果形态发生变化，则表明发生了有效转导。预期会出现大的聚集细胞。
  11. 将细胞放入 37°C、5% CO2 培养箱并培养2天。
    注：孵育细胞时（传代转导细胞前 1–2 天），为转导细胞的每个孔准备两个 60 mm MEF 培养皿。

    第3天：将细胞铺于 MEF 培养皿上。

  12. 使用所需方法（例如，Countess 自动细胞计数仪）进行细胞计数，并以每皿20,000和100,000个活细胞将细胞接种于 60 mm MEF 培养皿上的 5 mL 不含细胞因子的 StemPro-34 完全培养基。在 37°C 下孵育细胞。将多余细胞铺于另一个 MEF 培养皿中。

    第 3–6 天：更换用过的培养基。

  13. 每隔一天，从细胞中轻轻取出 2.5 mL（一半）用过的培养基，替换为 2.5 mL 不含细胞因子的新鲜 StemPro-34 完全培养基，操作过程中不要扰动细胞。

    第7天：开始过渡至人 iPSC 培养基。

  14. 按照“制备培养基”中的说明制备 100 mL 人 iPSC 完全培养基。
  15. 从细胞中取出 2.5 mL（一半）StemPro-34 培养基，替换为 2.5 mL 人 iPSC 培养基，开始将细胞过渡到新培养基。

    第8天至第28天：补料并监测细胞。

  16. 24小时后（第8天），将全部培养基更换为 iPSC 培养基，此后每天更换用过的培养基。
  17. 从第8天起，每隔一天在显微镜下观察培养板是否出现提示转化细胞的细胞团块（见图1）。
    注：对于 BJ 成纤维细胞，我们通常在转导后12天观察到集落形成。但是，根据您的细胞类型，您可能需要培养长达4周才能看到集落。
  18. 转导后第 15-20 天，集落应该已经生长到适于转移的大小。转移集落前一天，使用附着因子包被的12孔或24孔板制备 MEF 培养板。
    注：我们通常在接近3周时收获集落，以避免分化。
  19. 当集落可转移时，使用 Tra1-60 或 Tra1-81 进行活细胞染色，以选择重编程的集落。20.手动挑取集落并将其转移到准备好的 MEF 培养板上。
  20. 手动挑取集落并将其转移到准备好的 MEF 培养板上。

鉴定 iPSC 集落

转导后第21天，MEF 培养皿上的细胞集落会变大且紧密，覆盖培养皿的大部分表面积。然而，这些集落中只有一小部分由 iPSC 组成，这部分集落具有类似 hESC 的形态特征，外观类似于平坦的鹅卵石，集落中的细胞之间具有明显的界限（见图1）。因此，我们建议您使用可识别未分化 hESC 的 Tra1-60 或 Tra1-81 抗体进行活细胞染色。

注：虽然最早在转导后7天就可能出现“转化”细胞的集落，但这些集落中的大多数不是正确“重编程”的细胞。iPSC 通常稍晚出现（转导后第14天左右），形态类似于胚胎干细胞，表达细胞表面标志物 Tra1-60 和 Tra1-81。

图1.从 PBMC 中生成的 iPSC 的集落。将细胞在 PBMC 完全培养基（StemPro-34 SFM 完全培养基 + 细胞因子）中培养4天。在第0天（图 A）以 MOI 2–6 对细胞进行过夜转导。在第2天（图 B），细胞表现出显示重编程的形态学变化，并将其铺于 MEF 饲养层上。待细胞在不含细胞因子的 StemPro-34 完全培养基中的 MEF 饲养层上增殖，并在第5天（图 C）至第9天（图 D）观察到集落形成。

 

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用抗体进行活细胞染色

选择重编程集落的最快、最可靠的方法之一是用可识别未分化 iPSC 并能够从多种人类细胞类型中鉴定出重编程细胞的 Tra1-60 或 Tra1-81 抗体进行活细胞染色。
注：也可以采用其他鉴定 iPSC 的方法（如碱性磷酸酶染色）。1.

  1. 从重编程培养皿中吸出培养基。
  2. 使用 1X KnockOut DMEM/F-12 洗涤细胞一次。
  3. 将稀释的一抗加入细胞中（每 100 mm 培养皿添加 6 mL）。
  4. 将一抗和细胞在 37°C 下孵育60分钟。
  5. 从培养皿中去除一抗溶液。
    注：一抗溶液可在 4°C 条件下储存1周，最多可重复使用2次。
  6. 使用 KnockOut DMEM/F-12 洗涤细胞三次。
  7. 将稀释的二抗加入细胞中（每 100 mm 培养皿添加 6 mL）。
  8. 将二抗和细胞在 37°C 下孵育60分钟。
  9. 从培养皿中去除二抗溶液。
    注：二抗溶液可在 4°C 条件下储存1周，最多可重复使用2次。
  10. 使用 KnockOut DMEM/F-12 洗涤细胞三次，添加新鲜的 KnockOut DMEM/F-12 覆盖细胞表面（每 100 mm 培养皿添加 6 mL）。
  11. 在标准荧光显微镜下观察细胞，并标记成功重编程的集落进行挑取和扩增。成功的抗体染色可极具特异性地区分
    重编程的集落与普通转化的集落，并且可以检测长达 24–36 小时。这一点特别有用，因为它有助于在挑取前和转移到新培养皿中进行扩增后的第二天鉴定和追踪候选 iPS 集落。

挑取 iPSC 集落

  1. 将含有重编程细胞的培养皿置于倒置显微镜下，并在 10X 放大条件下检查集落。
  2. 在培养皿底部标记待挑取的集落。
    注：我们建议在每次重编程实验结束时挑取至少10个不同的集落，并在单独的24孔 MEF 培养板中扩增（见下文）。
  3. 将培养皿转移至配备体视显微镜的无菌细胞培养通风橱（即生物安全柜）中
    。
  4. 使用25号 1½ 英寸针头，将待挑取的集落切成 5–6 片网格状碎块。
  5. 使用 200 μL 移液器，将切下的小块转移至新鲜制备的含有人 iPSC 培养基的24孔 MEF 培养板中。
  6. 将含有挑取集落的 MEF 培养板置于 37°C、
    含 5% CO2 潮湿空气的培养箱中孵育。
  7. 让集落贴壁在培养板上48小时，然后用新鲜的人 iPSC 培养基替换用过的培养基。之后，每天更换培养基。
  8. 按照正常人 ESC 集落处理重编程的集落并使用标准培养程序进行传代、扩增和维持，直至从两个 60 mm 培养板中获得冷冻细胞。

生成无载体 iPSC

生成无载体 iPSC 的指南

  • 获得无载体 iPSC 所需的时间可能取决于培养和传代条件。对于人新生儿包皮成纤维细胞（BJ 株），在基因转导后约2个月可获得不含 CytoTune 仙台病毒重编程载体的 iPSC。
  • 为了更快地获得无病毒克隆，我们建议您对前几代（至少5代）进行单集落亚克隆，而不是进行批量或合并克隆传代。
  • 要进行单集落亚克隆，请从单个集落中挑取并转移至另一个6孔板（第1代）。从第1代选择单个集落并转移至另一个6孔板（第2代），以此类推。我们建议进行5代亚克隆，然后检测是否为无病毒 iPSC。

生成无载体 iPSC 的实验方案

  1. 对 iPSC 集落进行传代时，制备一式两份培养板；一块用于免疫染色，一块用于进一步
    传代。
  2. 使用抗 SeV 抗体在一块培养板上进行免疫染色（见下文）。
  3. 如果任何集落染色为阳性，则在另一块重复培养板上进行细胞克隆。
  4. 用抗 SeV 抗体对克隆集落重复免疫染色，直至培养板中的所有集落均为阴性。
  5. 如果所有集落均为抗 SeV 抗体阴性，则传代细胞，并通过 RT-PCR 确认不存在
    CytoTune 仙台病毒重编程载体。

使用抗 SeV 抗体的免疫细胞化学技术

  1. 使用 DPBS 洗涤细胞一次
  2. 在室温下使用 4% 多聚甲醛固定细胞5分钟。
  3. 用 DPBS 洗涤细胞两次。
  4. 向细胞中加入用含 0.1% Triton X-100 的 DPBS 稀释的抗 SeV 抗体（MBL，货号 PD029）并
    在 37°C 下孵育1小时。
  5. 去除抗体溶液。使用 DPBS 洗涤细胞3次。
  6. 加入用含 0.1% Triton X-100 的 DPBS 稀释的二抗，并在 37°C 下孵育1小时。
  7. 从培养皿中去除二抗溶液。使用 DPBS 洗涤细胞3次。
  8. 使用荧光显微镜观察细胞。

用于检测 SeV 基因组和转基因的 RT-PCR 方案

  1. 使用 TRIzol 试剂，按照随试剂提供的说明从 5 × 106 iPSC 中提取总 RNA。使用重编程程序最后一步留出的细胞作为阳性对照。
  2. 使用 1 μg RNA（来自上述步骤1）和 SuperScript® VILO™ cDNA 合成试剂盒，按照随试剂盒提供的说明进行逆转录反应。
    注：因为 CytoTune 仙台病毒重编程载体基于 SeV（一种 RNA 病毒），所以需要通过逆转录检测重编程细胞中是否存在 SeV 基因组。
  3. 使用来自逆转录反应（上述步骤2）的 10 μL cDNA 和
    AccuPrime™ SuperMix I，按照以下参数进行 PCR。RT-PCR 引物序列和预期产物大小见表2。
    步骤温度时间循环
    变性95°C30秒30–35
    退火55°C30秒30–35
    延伸72°C30秒30–35
  4. 使用 2% 琼脂糖凝胶电泳分析 PCR 产物。
    注：如果经过10次以上传代后，仍然可以在您的 iPSC 细胞系中检测到 CytoTune 仙台病毒，并且已通过 RT-PCR 显示您的细胞中没有 Oct4、Sox2 和 Klf4（这些载体没有温度敏感突变），那么您可以通过温度变化去除 cMyc 基因。CytoTune 仙台病毒 hc-Myc 在细胞中的存留时间往往比其他 CytoTune 仙台病毒重编程载体更长。然而，由于该载体包含温度敏感性突变，您可以通过将细胞在 38–39°C 下孵育5天来加强它的清除，以实现完全不含仙台病毒。

表2.用于检测使用 CytoTune 仙台病毒重编程载体重编程的细胞中 SeV 基因组和转基因的 RT-PCR 引物组

 

靶标引物组产品规格
SeV正向：GGA TCA CTA GGT GAT ATC GAG C*
反向：ACC AGA CAA GAG TTT AAG AGA TAT GTA TC*		181 bp
Sox2正向：ATG CAC CGC TAC GAC GTG AGC GC
反向：AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA*		451 bp
Klf4正向：TTC CTG CAT GCC AGA GGA GCC C
反向：AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA*		410 bp
cMyc正向：TAA CTG ACT AGC AGG CTT GTC G*
反向：TCC ACA TAC AGT CCT GGA TGA TGA TG		532 bp
Oct3/4正向：CCC GAA AGA GAA AGC GAA CCA G
反向：AAT GTA TCG AAG GTG CTC AA*		483 bp

 * 该引物包含 SeV 基因组序列。将这些引物与转基因特异性引物配对，可以特异性检测 CytoTune 仙台病毒重编程载体携带的转基因。请注意，Sox2、Klf2 和 Oct3/4 检测使用了相同的反向引物。

疑难解答

问题可能原因解决方案
转导后
观察到细胞毒性		病毒载量过高降低 CytoTune 载体量或增加起始细胞数。
培养板上的集落
过多		铺板细胞过多减少转导后铺板的细胞数量。
无 iPSC 集落形成所用的病毒量不足
  • 检查 CytoTune 载体量及起始细胞数。改变 MOI 可改善结果。
  • 并非所有类型的细胞都具有相同的重编程效率。使用 TaqMan 蛋白检测试剂盒检查细胞类型中的蛋白表达水平。
  • 请勿重新冻融或分装病毒。重新冷冻或解冻的试剂盒无法保证病毒滴度。
与 BJ 成纤维细胞相比，iPSC 集落数太少细胞类型无法有效重编程并非所有细胞类型都具有相同的重编程效率。增加铺板的细胞数量。
iPSC 集落已分化iPSC 集落转移至 MEF 培养皿的时间过晚更早进行染色，并将 iPSC 集落转移到新鲜的饲养层细胞中。
难以获得无载体 iPSC细胞类型不能有效消除 CytoTune 仙台病毒重编程载体
  • 与其他细胞株相比，一些细胞株可能需要更长的时间才可消除 CytoTune 仙台病毒载体从而变成无载体细胞株。进行重复克隆，直至通过使用抗 SeV 抗体的免疫细胞化学技术确定获得阴性细胞。
  • 如果通过用玻璃移液器转移一部分集落进行克隆，可能更容易获得 SeV 阴性集落。
  • 如果通过 RT PCR 确认您的细胞中不存在 Oct4、Sox2 和 Klf4 基因，仅存在 C-Myc，将细胞在 38–39°C 下孵育5天，iPSC 集落消除 CytoTune 仙台病毒载体的速率可能会增加。

附录

iPSC 冷冻培养基

  1. 在临用前制备冷冻培养基 A 和 B。
  2. 在 15 mL 无菌试管中，将制备每 1 mL 冷冻培养基 A 所需的以下试剂混合在一起：
    人 iPSC 培养基0.5 mL
    KnockOut 血清替代物0.5 mL
  3. 在另一个 15 mL 无菌试管中，将制备每 1 mL 冷冻培养基 B 所需的以下试剂混合在一起
    ：
    人 iPSC 培养基0.8 mL
    二甲基亚砜0.2 mL
  4. 将含冷冻培养基 B 的试管置于冰上直至使用（您可在室温下放置冷冻培养基 A
    ）。使用后弃去剩余的冻存培养基。

冷冻 iPSC

  1. 制备所需体积的新鲜冷冻培养基，并将其置于冰上。
  2. 吸出培养基，并用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS 冲洗培养皿两次（35 mm 培养皿使用 2 mL 或 60 mm 培养皿使用 4 mL）。
  3. 将 IV 型胶原酶溶液轻轻加入到培养皿中（在 35 mm 培养皿中加入 1 mL或在 60 mm 培养皿中加入 2 mL）。
  4. 将含细胞的培养皿在 37°C、含 5% CO2 潮湿空气的培养箱中孵育 5–20 分钟。
    注：不同批次的胶原酶的孵育时间可能不同。因此，合适的孵育
    时间应通过孵育过程中在显微镜下定期检查集落进行优化。
  5. 集落边缘开始脱离培养板时停止孵育。
  6. 从培养箱中取出培养皿，吸出 IV 型胶原酶溶液，并用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS 轻轻冲洗培养皿。
  7. 加入 2 mL iPSC 培养基或 DMEM/F-12，
    使用无菌移液器或细胞刮刀轻轻将细胞与培养皿表面分离。将细胞转移至 15 mL 无菌离心管中。使用额外的 iPSC 培养基或 DMEM/F-12 冲洗培养皿，以收集任何剩余的集落。
  8. 在室温下以 200 × g 离心细胞 2–4 分钟。
  9. 弃去上清液，轻弹试管，使细胞沉淀完全脱离试管底部，然后将细胞重悬于冷冻培养基 A 中。待细胞团均匀混悬后，向细胞悬液中逐滴加入等体积的冷冻培养基 B，同时轻轻涡旋细胞悬液以混匀。
    注：此时，细胞与 DMSO 接触，必须在无延迟或延迟最短的情况下高效处理
    。细胞与 DMSO 接触后，应在 2–3 分钟内完成分装并冷冻。
  10. 向各冻存管中分装 1 mL 细胞悬液。
  11. 将含有细胞的冻存管迅速置于冷冻容器（例如，Mr. Frosty）中，
    以每分钟降低 1°C 的速度冷冻细胞，然后将其转移至 -80°C 下过夜。
  12. 在 -80°C 下过夜储存后，将细胞转移至液氮罐气相中长期
    储存。

仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。

MAN0006712          2012年3月22日

仅供科研使用，不可用于诊断目的。