NSC 培养基、传代试剂以及络合培养基
| 成分 | 货号 |
|---|---|
| StemPro NSC SFM | A1050901 |
| CTS GlutaMAX-I 添加剂 | A1286001 |
| Geltrex 经 hESC 验证的无 LDEV 低生长因子基底膜基质 | A1413302 |
| 不含钙、镁离子的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) | 14190144 |
| StemPro Accutase 细胞解离试剂 | A1110501 |
| Opti-MEM I 减血清培养基 | 31985062 |
高效转染的理想起点是在成分明确的培养体系（如 Gibco StemPro NSC 无血清培养基 [SFM]）中于 Gibco Geltrex 基质上扩增未分化的人原代神经干细胞 (NSC) 或多能干细胞 (PSC) 来源的 NSC。
传代
- 按照您选择的培养方式（如由 Geltrex 基质包被的6孔板、60 cm 培养皿、T-25 培养瓶或 T-75 培养瓶）在 StemPro SFM 培养基中维持培养 NSC。在 T-25 培养瓶中增殖 NSC、在24孔板中转染是较为便捷的方式，本方案便采用了这些方式。
- 每 3-5 天在汇合度为 90%-100% 时，对 NSC 传代一次。
- 使用 Gibco StemPro Accutase 细胞解离试剂处理 NSC，获得用于扩增和接种以供转染的单细胞悬液。
使用 Geltrex 基质预包被24孔板以用于转染
- 取 Geltrex 基质，加入含有Gibco GlutaMAX 补充剂的冷 Gibco DMEM/F-12 培养基（货号 10565）中，制备 Geltrex 基质的 1:100 稀释液。
- 使用前，向24孔板的每个孔中加入 300 μL 稀释的 Geltrex 基质，并在 37℃ 下孵育 ≥1 小时。
- 小贴士：可提前制备用 Geltrex 基质包被的培养板，并在 4℃ 下储存最多2周。细胞铺板前，先在室温下平衡至少1小时。
接种用于转染的细胞
- 当 NSC 培养物汇合度约达 90%-100% 时，移除 StemPro NSC SFM。
- 用 10 mL 不含钙和镁离子的 DPBS 洗涤 NSC 一次；吸出培养基并丢弃。
- 向各 T-25 培养瓶中加入 1 mL 室温 StemPro Accutase 试剂，涡旋以均匀包被 NSC，并在室温下孵育 2-5 分钟。
重要说明：为最大限度提高转染效率，建议接种用 StemPro Accutase 试剂制备的 NSC 单细胞悬液。 - 在倒置显微镜上观察细胞，确认 NSC 已呈分离状态；必要时可用力敲击培养瓶帮助 NSC 分离。
- 加入 9 mL StemPro NSC SFM，以灭活 StemPro Accutase 试剂。
- 轻轻吹打并冲洗培养瓶以获得单细胞悬液，然后将细胞悬液转移至 15 mL 锥形管中。
- 以 200 x g 离心 NSC 细胞悬液4分钟。
- 吸出上清液，将细胞沉淀重悬于 3 mL StemPro NSC SFM 中，制成单细胞悬液。
- 使用 Invitrogen Countess II 自动细胞计数仪或其他方法进行总活细胞计数。
- 用额外的 StemPro NSC SFM 稀释至最终浓度为150,000个细胞/mL。
- 从预包被24孔板的各孔中吸出 Geltrex 基质。
重要说明：正在增殖的 NSC 培养物在转染期间需要空间进行扩增，所以请按推荐的起始细胞数（步骤12）进行铺板以在转染当天达到 30–60% 的汇合度。 - 向预包被的24孔板中加入使用 StemPro NSC SFM 制备的 0.5 mL NSC 悬液，以 75,000 个细胞/孔铺板。
- 将平板放回培养箱中，在 37℃、5% CO2 下过夜培养。
重要说明：转染当天无需更换培养基。
DNA 转染方案
请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对使用 Invitrogen Lipofectamine 干细胞转染试剂处理 NSC 进行了优化：
| 步骤 | 管 | 复合成分 | 用量/孔（24孔板） |
|---|---|---|---|
| 1 | 管1 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| Lipofectamine 干细胞试剂 | 1 μL | ||
| 2 | 管2 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| DNA (0.5–5 μg/μL) | 500 ng | ||
| 3 | 将管2溶液加入管1中，混匀。 | ||
| 4 | 将步骤3所得混合物在室温下孵育10分钟。 | ||
| 5 | 向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物； 轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。 | ||
| 6 | 将培养皿放回培养箱中，在 37℃、5% CO2 下过夜培养。 | ||
| 7 | 如果要对 NSC 进行48小时转染，则在第二天向每孔额外加入 0.5 mL StemPro NSC SFM。 | ||
转染效率分析
在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 NSC 以进行终点分析（图1）。
图1.NSC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 59%，(B) 明场图像。在 StemPro NSC SFM 中于 Geltrex 基质上用 500 ng 的 6 kb EF1α-GFP 质粒和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后24小时，显示出 NSC。
小贴士和技巧
- 实现最佳转染所需的 Lipofectamine 干细胞试剂用量取决于铺板的 NSC 量以及所用的 DNA 量。
- 如果 DNA 制备物具有明显的细胞毒性，则将 DNA 量减少至 250 ng/孔，可在维持高效转染的同时提高细胞活率。
- 对于转染效率评估，关键的一点是所用的质粒需含有在人 NSC 中具有活性的启动子（如 EF1α 启动子）；一些启动子（如巨细胞病毒 [CMV] 启动子）可导致 NSC 转录沉默。
mRNA 转染方案
请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对使用 Lipofectamine 干细胞试剂处理 NSC 进行了优化：
| 步骤 | 管 | 复合成分 | 用量/孔（24孔板） |
|---|---|---|---|
| 1 | 管1 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| Lipofectamine 干细胞试剂 | 1 μL | ||
| 2 | 管2 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| mRNA (0.5–5 μg/μL) | 250 ng | ||
| 3 | 将管2溶液加入管1中，混匀。 | ||
| 4 | 将步骤3所得混合物在室温下孵育10分钟。 | ||
| 5 | 向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物； 轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。 | ||
| 6 | 将培养皿放回培养箱中，在 37℃、5% CO2 下过夜培养。 | ||
| 7 | 如果要对 NSC 进行48小时转染，则在第二天向每孔额外加入 0.5 mL StemPro NSC SFM。 | ||
转染效率分析
在转染后24小时和48小时，通过荧光显微镜或流式细胞仪观察经荧光 mRNA 转染的 PSC 以进行终点分析（图2）。
图2.NSC 转染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 70%，(B) 明场图像。在 StemPro NSC SFM 中于 Geltrex 基质上用 250 ng GFP mRNA 和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后36小时，显示出 iPSC 来源的 NSC (NCRM1)。
小贴士和技巧
- 生成特定生物读数所需的 mRNA 量因用户的应用而异；Lipofectamine 干细胞试剂可在一系列用量范围内将 mRNA 高效地递送到 NSC 中。
- 除目标转录本之外，纳入的独立 GFP mRNA (50 ng)，可独立评估转染效率。
- 如果 mRNA 制备物具有明显的细胞毒性，则将 mRNA 量减少至 125 ng/孔，可在维持高效转染的同时提高细胞活率。
- 体外转录 (IVT) mRNA 的生成和纯化方法可导致毒性以及翻译阻遏。
- 用于体外转录的 Invitrogen mMESSAGE mMACHINE 试剂盒中包含的抗反向帽类似物 (ARCA) 系统和 Invitrogen MEGAclear 柱可用于去除未加帽的转录本和能导致细胞毒性的小型未掺入核苷酸。
核糖核蛋白 (RNP) 转染方案
RNP 复合成分：
- Invitrogen GeneArt Platinum Cas9 核酸酶（货号 B25641）
- gRNA（参见“通过体外转录法设计和生成 gRNA”）
请按照以下步骤进行操作，这些步骤已针对使用 Lipofectamine 干细胞试剂处理 NSC 进行了优化：
| 步骤 | 管 | 复合成分 | 用量/孔（24孔板） |
|---|---|---|---|
| 1 | 管1 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| Lipofectamine 干细胞试剂 | 1 μL | ||
| 2 | 管2 | Opti-MEM I 培养基 | 25 μL |
| Cas9 核酸酶 | 500 ng | ||
| gRNA (0.1–0.5 μg/μL) | 125 ng | ||
| 3 | 将管2溶液加入管1中，混匀。 | ||
| 4 | 将步骤3所得混合物在室温下孵育10分钟。 | ||
| 5 | 向每孔加入 50 μL 步骤4所得复合物； 轻轻涡旋平板，确保复合物均匀分布至整个孔中。 | ||
| 6 | 将培养皿放回培养箱中，在 37℃、5% CO2 下过夜培养。 | ||
| 7 | 如果要对 NSC 进行48小时转染，则在第二天向每孔额外加入 0.5 mL StemPro NSC SFM。 | ||
转染效率分析
在转染后24小时和48小时，使用荧光显微镜或流式细胞仪观察经 GFP 报告基因构建体转染的 PSC，并使用 Invitrogen GeneArt 基因组剪切检测试剂盒或类似检测试剂盒分析双链断裂 (DSB) 形成情况（图3）。
图3.NSC 染后分析。(A) 荧光图像显示，转染效率为 60%，(B) 明场图像。在 StemPro NSC SFM 中于 Geltrex 基质上用 500 ng GeneArt Platinum Cas9 核酸酶、125 ng gRNA、50 ng GFP mRNA 和 1 μL Lipofectamine 干细胞试剂转染后24小时，显示出 iPSC 来源的 NSC (NCRM1)。(C) 转染后48小时，iPSC 来源的 NSC 的基因组剪切检测分析显示，EMX1 基因座内形成 56% 的 indel。
小贴士和技巧
- 在转染复合物中加入 50 ng 的 GFP mRNA 以及 RNP 复合物可以提供转染效率的独立测量指标。
通过体外转录法设计和生成 gRNA
除 RNP 转染效率外，在给定基因座处 DSB/indel 形成的效率也可能取决于 gRNA 设计。使用 Invitrogen GeneArt CRISPR 检索和设计工具（获取链接：thermofisher.com/crisprdesign）来检索我们数据库中针对人类基因组中每个基因的 >600,000 条预设计 gRNA 序列。这些预设计的 gRNA 针对基因敲除进行了优化，且通常以每个基因的前三个转录外显子为靶标。
使用 Invitrogen GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒（货号 A29377）克隆并生成您自己的 gRNA。可采用 Invitrogen Qubit 3 荧光计（货号：Q33216）联合 Invitrogen Qubit RNA BR 检测试剂盒（货号：Q10210）定量测定 gRNA 浓度。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。