计数员  _____________________________                 肝细胞批号_________________________

日期  _____________________                                              项目 ID  ___________________


台盼蓝计数结果

细胞活力计算

活细胞            /              总细胞                     =                 活力 %
                             /                                                      =
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总得率计算

总细胞    /    象限计数   x   稀释因子    x    10,000    x    当前体积 (mL)   =   总细胞得率
                       /                                          x                            2  x    10,000    x                                              =   x 10⁶ 个细胞


细胞形态注释


透明细胞质                    
圆形                  
透明/清晰的细胞膜            
极小碎片                     
细胞器肿胀
细胞膜起泡
脂滴
遍布碎片

备注：_________________________________________________________________________

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接种密度计算

总细胞得率                  /        所需密度*                       =              所需总体积
                  x 10⁶ 个细胞       /                           x    x 10⁶ 个细胞/mL    =                                                 mL


所需总体积         -       当前总体积               =               要添加至细胞储备液的体积
                                         mL -                                                      mL=                                                mL
                            

* 请参阅供应商的建议。对于24孔板，人铺板肝细胞的理想密度通常为 0.75 x 10⁶ 个细胞/mL、0.8 x 10⁶ 个细胞/mL 或 0.9 x 10⁶ 个细胞/mL。悬浮所用密度或其他物种的密度将有所不同。

叠加计算

所需 4°C 培养基的总体积*  x   最终凝胶浓度 / 初始蛋白质浓度^†  =  要加入 4°C 培养基的凝胶储备液体积
                                                      mL x     0.35 mg/mL              /                                          mL =                                      mL

* 培养基需要置于冰上保持 4°C。我们建议 Williams 培养基 E（Life Technologies 货号 CM6000）与无血清维持培养添加剂包（Life Technologies 货号 CM4000）结合使用。
† 请参阅供应商的规格表。我们建议使用 Geltrex™ 低生长因子基底膜基质（Invitrogen 货号 12760-021），浓度为 0.35 mg/mL。

需要帮助？有关肝细胞产品的技术支持，请访问 www.lifetechnologies.com/hepatocytes，
发送电子邮件至 hepaticproducts@lifetech.com，或通过以下电话联系我们：+1 866 952 3559（美国免费热线）；+1 919 237 4500（收费热线）；+44 (0)141 814 5900（欧洲）。

提前准备冻存肝细胞

注释：处理原代肝细胞时请使用通用安全预防措施和适当的生物安全柜。

• 在 37°C 水浴中快速解冻冻存肝细胞（<2 分钟），并立即在 37°C 解冻培养基中对细胞进行稀释。使用解冻培养基冲洗冻存管以去除所有细胞，然后低速离心以去除冷冻保护剂（请参阅供应商的指示）。例如，应将解冻的人肝细胞快速转移至 40 mL 37°C CHRM® 培养基（Life Technologies 货号 CM7000）中，并以 100 x g 的设置离心10分钟。
• 使用预热至 37°C 的含血清培养基轻柔地将肝细胞重悬至浓度约为 10⁶ 个细胞/mL。对于要铺到胶原蛋白包被板上的肝细胞，我们建议使用添加了含血清铺板添加剂包（Life Technologies 货号 CM3000）的 Williams 培养基 E（Life Technologies 货号 CM6000）。

准备细胞计数样本瓶

1. 将 200 μL 缓冲液（PBS 或类似溶液）或培养基与 50 μL 0.4% 台盼蓝染色液（货号 T10282）混合于 2.0 mL 圆底微量离心管中，以制备台盼蓝储备溶液。将 50 μL 稀释后的台盼蓝溶液转移到另一用于细胞计数的 2.0 mL 样本瓶（即细胞计数样本瓶）中。


2. 在向计数样本瓶中加入肝细胞悬液之前，轻轻翻转肝细胞试管数次，确保悬液均匀。此步骤对于获得准确的细胞计数至关重要。


3. 使用广口吸头将 50 μL 肝细胞悬液移入细胞计数样本瓶中，方法是通过一次抽吸将悬液吸入移液器吸头，然后将内容物分配到细胞计数样本瓶中。切勿冲洗吸头。否则会导致原始细胞悬液发生2倍稀释。


4. 轻敲/轻拍计数样本瓶以确保混合物均匀。切勿剧烈摇动或搅拌，否则会导致细胞死亡，并导致细胞活力测定不准确。
   
   准备血细胞计数器
   


5. 等待一分钟，再次轻敲/轻拍计数样本瓶进行混合，然后用移液管缓慢地将 10 μL 混合物移到血细胞计数器一侧的 V 形凹槽中。细胞悬液在毛细管作用下被吸到血细胞计数器中。


6. 计数前，在显微镜下快速扫描象限，确保细胞均匀分布。如果血细胞计数器上样不均匀或含有气泡，请重新上样。
   
   肝细胞计数
   


7. 立即对血细胞计数器四个外象限中的活肝细胞（透明或黄色）和死肝细胞（蓝色）进行计数，包括两条外象限线上的任何细胞（图1）。长时间暴露于台盼蓝会导致细胞死亡，因此请勿延迟计数。


8. 在本页背面记录结果，并执行指示的计算以确定活肝细胞的总数。使用额外的含添加剂的铺板培养基或同等培养基，将肝细胞混合物稀释至所需的最终细胞浓度。