定量聚合酶链反应 (qPCR) 是一种研究基因调控的极为准确和灵敏的方法，可用于测定神经干细胞 (NSC) 中特定基因的表达水平。这些基因可用于鉴定 NSC 及其各自的亚谱系。在此，我们提供了使用 Applied Biosystems 7300 实时荧光定量 PCR 系统和 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 及 ROX 参比染料进行 qPCR 的指南和通用方案。
所需材料
起始材料
从神经干细胞 (NSC) 分离的总 RNA 生成的 cDNA（参见“神经干细胞的 RNA 分离和 cDNA 制备”）
培养基和试剂
专用工具
所需材料
起始材料
从神经干细胞 (NSC) 分离的总 RNA 生成的 cDNA（参见“神经干细胞的 RNA 分离和 cDNA 制备”）
培养基和试剂
- Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG（货号11733-038、11733-046）
- SuperScript® VILO™ cDNA 合成试剂盒（货号11754-050、11754-250）
- TRIzol® 试剂（货号15596-018、15596-026）
- 定制引物
专用工具
- Applied Biosystems 7300 实时荧光定量 PCR 系统或类似仪器
- 0.2 mL 微量离心管或 96 孔或 384 孔 PCR 板
- 涡旋混合器
- 微量离心机
模板制备
进行 qPCR 之前，按照“神经干细胞的 RNA 分离和 cDNA 制备”中描述的方案，制备由 10 pg-1 μg 总 RNA 生成的 cDNA 的 1:10 连续稀释液。
实时荧光定量 PCR 仪
Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 可与多种实时仪器配合使用，包括但不限于以下 Applied Biosystems 仪器：7300 和 7500 实时荧光定量 PCR 系统；PRISM® 7000、7700 和 7900HT；以及 GeneAmp® 5700。不同仪器的最佳循环条件不同。
引物设计
引物设计是使用 SYBR® Green qPCR 检测系统时最重要的参数之一。我们强烈建议使用引物设计程序，如 OligoPerfect™ 或 Vector NTI Advance® 软件。设计引物时，扩增子长度应约为 80-250 bp。要获得较佳结果，可能需要在
100 nM 和 500 nM 范围内调整引物浓度。对于大多数反应，每条引物的最终浓度为 200 nM 时反应效率较高。
ROX 参比染料
建议使用 ROX 参比染料，从而对兼容该选项的仪器的荧光报告基因信号进行归一化。ROX 在 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 中以单管规格提供，浓度为 25 μM。使用下表确定与特定仪器配合使用时的 ROX 用量。
qPCR 方案
图 1. 人胚胎干细胞衍生 NSC 中的巢蛋白转录本的 qPCR 检测。
图 2. 人胚胎干细胞衍生 NSC 中的 Sox1 转录本的 qPCR 检测。
进行 qPCR 之前，按照“神经干细胞的 RNA 分离和 cDNA 制备”中描述的方案，制备由 10 pg-1 μg 总 RNA 生成的 cDNA 的 1:10 连续稀释液。
实时荧光定量 PCR 仪
Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 可与多种实时仪器配合使用，包括但不限于以下 Applied Biosystems 仪器：7300 和 7500 实时荧光定量 PCR 系统；PRISM® 7000、7700 和 7900HT；以及 GeneAmp® 5700。不同仪器的最佳循环条件不同。
引物设计
引物设计是使用 SYBR® Green qPCR 检测系统时最重要的参数之一。我们强烈建议使用引物设计程序，如 OligoPerfect™ 或 Vector NTI Advance® 软件。设计引物时，扩增子长度应约为 80-250 bp。要获得较佳结果，可能需要在
100 nM 和 500 nM 范围内调整引物浓度。对于大多数反应，每条引物的最终浓度为 200 nM 时反应效率较高。
ROX 参比染料
建议使用 ROX 参比染料，从而对兼容该选项的仪器的荧光报告基因信号进行归一化。ROX 在 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 中以单管规格提供，浓度为 25 μM。使用下表确定与特定仪器配合使用时的 ROX 用量。
| 仪器 | 每 50 μL 反应体系的 ROX 用量 | ROX 最终浓度 |
|---|---|---|
| Applied Biosystems 7300、7000、7700、7900HT 和 7900HT Fast | 1.0 μL | 500 nM |
| Applied Biosystems 7500 | 0.1 μL | 50 nM |
qPCR 方案
在本部分中，我们提供了在 7300 实时荧光定量 PCR 系统 (Applied Biosystems) 上以 20 μL 规格进行 qPCR 的分步方案。
- 按如下所示对实时仪器进行编程。最佳温度和孵育时间可能有所不同。
- 50°C 保持 2 分钟（UDG 孵育）
- 95°C 保持 2 分钟
- 40-50 个以下循环：
- 95°C，15 秒
- 60°C，30 秒
熔解曲线分析：对仪器进行编程用于熔解曲线分析，以确定是否存在引物二聚体，并分析反应的特异性。下面列出了典型的熔解曲线程序（有关详细信息，请参阅您的仪器文件）：
• 95°C 保持约 30 秒
• 45°C 保持约 30 秒
• 99°C 保持约 30 秒
升温速率为 2%，收集 45-99°C 的数据
注：在以下步骤中，请勿触摸每支管的底部，并确保佩戴无粉手套操作所有试剂和塑料器具。 - 对于每个反应，向 0.2 mL 微量离心管或 PCR 板的各孔中加入以下组分。列出了单个 20 μL 反应体系所需的体积。对于多重反应，制备共同组分的预混液，向各管或板孔中加入适当的体积，然后加入特有的反应组分（例如模板）。对于无模板对照，可加入等体积的水代替模板。
组分 用量 Platinum® SYBR® Green qPCR SuperMix-UDG 10 μL ROX 参比染料（用量根据 AB 7300 系统确定） 0.4 μL 正向引物，10 μL 0.4 μL 反向引物，10 μL 0.4 μL 模板 cDNA（来自 10 pg 至 1 μg 总 RNA 的 1:10 连续稀释液） 1-2 μL 经 DEPC 处理的水 加至 20 μL - 盖上或密封反应管/PCR 板，轻轻混匀。确保所有组分都在试管/平板的底部；如有需要可短暂离心。
- 将反应体系放置在预热的实时仪器中，仪器按步骤 1 中所述进行编程。使用仪器软件收集数据并分析结果。
图 1. 人胚胎干细胞衍生 NSC 中的巢蛋白转录本的 qPCR 检测。
图 2. 人胚胎干细胞衍生 NSC 中的 Sox1 转录本的 qPCR 检测。
LT145 2011 年 3 月 17 日