フローサイトメトリーパネルビルダー

サイトメーターの構成を知ることは、パネル設計の最初のステップです。70以上の機器を含むドロップダウンメニューからサイトメーターを選択してください。

表示されているバンドパスフィルターが使用する機器のものと一致しない場合は、必要に応じて「サイトメーター設定の編集」をクリックして、レーザー、チャンネル、またはバンドパスフィルターを調整してください。

お客様のサイトメーターが見つからない場合は、手動で構成を入力してください。レーザーを選択して、サイトメーターに必要なチャンネルとフィルターを設定してください。

すでにお客様の研究室にあるため購入する必要のない重要な抗体コンジュゲートを使用してこのパネルを設計しますか？　　　 その場合は「はい」をクリックして、抗原名、蛍光色素、および目的のチャンネルを入力してください。次に「パネルに追加」をクリックしてください。

ドロップダウンメニューからターゲットとなる生物種を選択して、その他の抗原の追加を開始してください。すべての抗原が列記されるまで、「別の抗原を追加」をクリックして必要な抗原を入力してください。

「Protein abundance」を選択し、バーを高から低に移動させます。どのレベルにすべきかわからない場合は、中間点に置きます。これを追加することで、パネルビルダープログラムがステップ3において蛍光色素を提案するのに役立ちます。

特定のクローンを指定したい場合は、詳細オプションを使用して目的のクローンを選択してください。

ダンプチャンネルに何かを割り当てたいですか？抗原の詳細オプションを開き、スライダーを右に動かして「はい」を選択してください。これにより、このチャンネルに複数の抗原を割り当てることができます。

生存率解析用色素をお忘れなく！ 固定可能または固定不可オプションを選択してください。

蛍光色素の選択は、各蛍光色素のスペクトル情報によりガイドされます。このステップでは、左側に表示されている各抗原に対して蛍光色素を選択すると、ページ上部の左右全体にわたり、選択した蛍光色素のスペクトルを視覚化できます。

選択する前に、各抗体に対して利用可能なチャンネルの数が表示されます。各抗原を選択するたびに別のスペクトルがページ上部に表示されます。マトリックス表示では、抗原が行に列記され、チャンネルが列に表示されます。

コーナーの黒色のフラグは、ステップ2のタンパク質量に基づいて推奨される蛍光色素の選択肢を示しています。

蛍光色素の選択を開始してください。利用可能な蛍光色素オプションがもっとも少ない抗原が1番上に記されています。ここから開始してください。蛍光物質オプションがもっとも多い1番下の抗原まで、表を下にたどってください。蛍光色素の選択をガイドするために、スペクトル情報が提供されています。一般に、スペクトルの重なりがもっとも小さいのが最良です。

すべての抗原を蛍光色素とマッチさせるために、オプションの選択を続けてください。完了後、SpectraViewerボタンをクリックして、オプションの選択がお客様の機器に対応していることを確認してください。

レーザーあたりのすべての蛍光色素の全スペクトルが表示され、ラベルされます。機器のバンドパスフィルターで捕捉される推定光を確認してください。理論的スピルオーバー値をチェックして、問題がないかを必ず確認してください。

選択したい蛍光色素が表示されていない場合は、クリックしてプレースホルダー蛍光色素を追加してください。

蛍光色素を入力し、「追加および選択」をクリックしてパネルに追加してください。

他の蛍光色素が列記されていなくても、プレースホルダー蛍光色素はいつでも使用できます。プラス記号をクリックして、最適な蛍光色素を入力し選択してください。SpectraViewerリンクをクリックすると、選択した蛍光色素を視覚化できます。

複雑性スコアが低い蛍光色素を選択してください。

より濃い色のボックスは分離の難度を示しています。スコアが低いほど、より容易かつ正確に分離できます。複雑性スコアが低いとより良好に分離される傾向にあり、 フルオロフォアはより容易に区別されます。

ご希望の製品と包装サイズを選択してください。先のステップでクローンを指定しなかった場合は、さまざまなクローンが表示されます。

製品選択を完了後、ステップ5ではレーザータイプごとに選択したすべての抗体と、サイトメーターのフィルターセットにより捕捉される励起スペクトルを確認できます。

フルオロフォアはさまざまな輝度で発光します（図2）。パネルビルダーで蛍光色素を選択する際、以下を行うことが推奨されます：

• 特定のフローサイトメーターに適した染色インデックスを使用する。染色インデックスは、機器メーカーからチャートまたは表として提供されます。メーカーはそのメーカーの機器を使用して、同じクローンに異なるコンジュゲートを結合させてテストしています。フロー捕捉ビーズで染色インデックスを作成することもできます。例えば図2は、Attune NxT Flow Cytometerで解析したもっとも一般的な蛍光色素の染色インデックスを示しています。各フローサイトメーターのレーザー、フィルター、および検出器は異なり、蛍光色素に結合したマーカーから観察されるシグナルに影響を与える可能性があります。
• 発現タンパク質のレベルに基づいて、蛍光色素の輝度の組み合わせを選択する。非常に明るい蛍光色素のみを使用するとスピルオーバーが発生し、マーカーのシグナルが減衰する可能性があります。
• 各蛍光色素および抗体クローンの蛍光強度の平均を調べて、輝度を比較する。これらは製品データシートに記載されています。

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