电子显微镜

使用冷冻电镜进行的制药研究

如何使用冷冻电子显微镜进行制药研究。

 

自从“分辨率革命”开始以来，人们对冷冻电镜的热情不断提高，而且迄今没有停止的迹象。对蛋白质结构测定的开拓性贡献继续飞速推进。越来越多的制药公司与赛默飞世尔科技合作挖掘冷冻电镜在制药研究中的优势。

大多数作为药物靶标的目标蛋白质是大型不对称蛋白质，并且以复合物形式发挥作用。现有分析技术仅适用于一小部分可能的蛋白质分析物。实际上，在晶体学解析的蛋白质数据库 (PDB) 中，只有极少数结构是由四条以上链组成的复杂结构。冷冻电镜可以对大型蛋白质复合物进行高分辨率成像，无需结晶，从而提供关于药物靶标和疾病机制的关键信息。

 

冷冻电镜在制药领域的成功

想要了解您的药物发现如何从冷冻电镜中受益？从同行制药研究的成功中学习。这种方法的优势已在制药公司的出版物中得到验证，证明了冷冻电镜如何在加速药物发现所需的结构性洞见方面取得前所未有的成果。

以下近期出版物提供了冷冻电镜如何在不同疾病领域针对多种药物靶标提供关键的结构洞见。在几种情况下，冷冻电镜提供了其他方法难以获得的洞见，从而加速了药物发现进程。

在阅读以下同行制药研究的成功案例后，您可能想知道冷冻电镜是否是您和贵公司一项有价值的投资。衡量冷冻电镜可行性的一种方法是，根据您的具体情况和用例计算商业案例和投资回报率 (ROI)。

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近期冷冻电镜出版物


小分子药物

不结晶靶标

Roche：视紫红质-Gαi-βγ 的冷冻电镜结构

冷冻电镜可揭示视紫红质和 Gi 异三聚体的抗体稳定复合物结构。

GPCR 通过激活多种细胞内传感器、突出异三聚体 G 蛋白来调节细胞生理。尽管结构数据激增，但对 GPCR 介导信号转导的许多方面（包括瞬态相互作用的存在）的了解仍难以捉摸。使用抗体 Fab 片段稳定的牛视紫红质与 GI 蛋白异三聚体之间的信号复合物的冷冻电镜结构得到了测定。

Cryo-EM structure of the rhodopsin-Gi-Fab16 complex.
视紫红质-Gi-Fab16 复合物的冷冻电镜结构。复合物的电镜密度图（视紫红质 – 蓝色、Gai – 绿色、GB – 黄色、Gg – 品红色、Fab16 – 白色）。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-Entry 6qno 的图像。
Cryo-EM structure of the rhodopsin-Gai-bg complex reveals binding of the rhodopsin C-terminal tail to the gb subunit；Tsai 等人 eLife 2019；8:e46041，2019 年 6 月发布。
目标
通过冷冻电镜比较所有可用 GPCR/G 蛋白复合物中受体与 A5 螺旋之间的残留物间接触的 GPCR-G 蛋白结合界面。
冷冻电镜的优势
冷冻电镜结构与和 mini-Go 蛋白螺旋及受体结合的同一视紫红质突变体的晶体结构一致性很高。
只有 EM 密度图可以为受体 C 尾与 Gb 亚单位之间的相互作用提供结构证据。

赛默飞世尔科技与莫纳什大学：B 类 GPCR-G-蛋白复合物的冷冻电镜结构

冷冻电镜可用于为 2 型糖尿病找到更安全、更有效的新口服药物。

B 类 G 蛋白偶联受体是包括糖尿病和肥胖症在内的慢性疾病治疗的主要靶标。胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP1R) 是治疗 2 型糖尿病的重要靶标。大多数 GLP1R 激动剂是注射药物，该受体的治疗潜力远未用尽。活性受体的结构表明，肽激动剂深入受体核心。

Cryo-EM density map of a GPCR complex: glucagon-like peptide-1 receptor (GLP1R).
GPCR 复合物的冷冻电镜密度图：胰高血糖素样肽-1 受体 (GLP1R)。与胰高血糖素样肽-1 (GLP-1) 受体结合的非肽激动剂 (TT-OAD2)。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-Entry 6ORV 的图像。
Phase-plate cryo-EM structure of a class B GPCR–G-protein complex；Liang, YL 等人，Nature v. 546，第 118-123 页，2017 年 6 月。
目标
使用冷冻电镜识别非肽的新激动剂口袋。
冷冻电镜的优势
与 GLP-1 受体结合的新型非肽激活剂的冷冻电镜结构发现了未预测到的非肽激动剂结合口袋。

Genentech (Roche)：选择性钠通道抑制的结构基础

冷冻电镜在阐释选择性钠通道阻滞剂方面为晶体学提供了补充。

电压门控钠（导航）通道是疾病突变、毒素和治疗药物的靶标。导航通道亚型中的突变与偏头痛、癫痫、疼痛以及心脏和肌肉麻痹综合征有关。通道阻滞剂缺乏亚型选择性，对其的了解并不充分。

Genentech (Roche): Structural basis of selective sodium channel inhibition
冷冻电镜结构清晰地显示了与激活（蓝色、品红色）和与未激活（黑色）受体结合的 ProTx2 的结构差异比较情况。图像基于 Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建的 PDB-Entry 6n4r 和 6n4q。
Structural Basis of Nav1.7 Inhibition by a Gating-Modifier Spider Toxin；Xu 等人，2019 年，Cell 176，702–715，出版日期：2019 年 2 月 7 日。
目标
确定使用蜘蛛原毒素-II (ProTx2) 设计选择性导航通道的关键结构模板。
冷冻电镜的优势
冷冻电镜分析独立验证了受体位点的晶体结构模型。
结晶结构的解释花费了多年时间。浸泡在化合物未获成功，因此冷冻电镜成了终极选择。
冷冻电镜结构支持通过转变导航的激活和在药理学上稳定封闭通道状态对 ProTx2 复合物进行机械解读。

Pfizer：人源共济蛋白结合铁硫簇组装复合物的结构

冷冻电镜可以深入了解弗里德希共济失调的临床突变。

位于粒线体基质中的铁硫簇 (ISC) 是包含共济蛋白 (FXN) 激活的半胱氨酸脱硫酶的五种蛋白复合物。FXN 的缺陷导致弗里德希共济失调 (FRDA)，这是一种遗传性神经退行性疾病，会导致心脏症状、肢体感知丧失、关节炎症状、言语障碍和神经损伤。

Pfizer: Structure of the human frataxin-bound iron-sulfur cluster assembly complex
在该复合物中，每个 FXN 都与由同二聚体和一个 ISC 的界面形成的模腔相结合。用 B 因子染色，蓝色 (b=10) 白色 (b=40) 红色 (b=70) 和带共济蛋白的 ISCU 表面。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-Entry 6NZU 的图像。
Structure of the human frataxin-bound iron-sulfur cluster assembly complex provides insight into its activation mechanism；Nicholas G. Fox 等人，Nature Communications 10，文章编号：2210 (2019)，出版日期：2019 年 5 月 17 日。
目标
确定复杂结构以了解 FXN 如何稳定 ISC；为 FRDA 临床突变指引方向。
冷冻电镜的优势
FXN 结合人复合物的结构是膜蛋白和可溶性蛋白这两种蛋白所报道的极少数 < 200 kDa 和 < 3.5 Å 分辨率的冷冻电镜结构之一。
冷冻电镜在这方面被应用于对 X 射线晶体学来说仍然难解的临床相关靶标。

GSK：通过寄生虫酶抑制治疗黑热病的临床前候选药物

冷冻电镜结构可以揭示寄生虫酶的新的、有效的、选择性抑制剂。

内脏利什曼病 (VL) 或称黑热病是最严重的热带疾病之一。它每年造成多达 40,000 人死亡。目前的治疗方法有严重缺陷，如治疗时间长、低耐受性和高致畸性、效力的地域性差异显著以及治疗和冷藏成本高昂。新的 GSK 临床前候选药物可抑制人体酶上的胰凝乳蛋白酶样活性，同时选择性抑制寄生虫酶。

Leishmania tarentolae proteasome 20S subunit
塔伦托利什曼原虫蛋白酶体 20S 亚基。黄色 α 型亚基、绿色 β 型亚基、橙色中性内肽酶、蓝色 GSK3494245。图像基于 Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建的 PDB-Entry 6qm7。
Preclinical candidate for the treatment of visceral leishmaniasis that acts through proteasome inhibition；Wyllie 等人，PNAS 2019 年 5 月 7 日 116 (19) 9318-9323，出版日期：2019 年 4 月 8 日。
目标
根据寄生虫酶的抑制情况找到 VL 的低成本、安全、有效的口服短期药物。
冷冻电镜的优势
高分辨率冷冻电镜结构揭示了以前未发现的胰凝乳蛋白酶样活性抑制剂的结合位点。

Nimbus Therapeutics：提高 ATP 柠檬酸裂解酶的“成药性”

冷冻电镜揭示了可提高 ACLY“成药性”的变构位点。

ATP 柠檬酸裂解酶 (ACLY) 是一种中央代谢酶，可催化柠檬酸和辅酶 A (CoA) 的 ATP 依赖转换为草酰乙酸和乙酰-CoA1。ACLY 是一种值得关注的抗癌药物靶标，因为癌细胞依赖其活性进行增殖。ACLY 也是抗血脂异常和肝性脂肪变性的一种靶标。靶标的结构-活性关系通过 ACLY 四聚物的结合模式进行解释。

3D structure of ACL tetramer at 3.7 Å using cryo-EM. ADP in yellow, inhibitor in Tyrian purple
3.7A 下使用冷冻电镜获得的 ACL 四聚物 3D 结构。ADP 为黄色，抑制剂为骨螺紫色。图像基于 Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建的 PDB-Entry 6o0h。
An allosteric mechanism for potent inhibition of human ATP-citrate lyase；Jia Wei 等人；Nature 568，566–570 (2019)，出版日期：2019 年 4 月 3 日。
目标
将以前未发现的变构 ACLY 结合位点作为增强抑制剂“成药性”的靶标进行研究。
冷冻电镜的优势
有史以来第一个高分辨率 ACLY 结构。
冷冻电镜连同计算见解，确定了具有小分子“成药”抑制剂的全四聚体 ALCY 结构。

Genentech：分泌型免疫球蛋白 A (sIgA) 核心的结构

冷冻电镜可确定潜在抗体治疗的二聚体、四聚体和五聚体 sIgA 框架。

分泌型免疫球蛋白 A (sIgA) 是免疫系统对抗黏膜病原体的第一道防线。IgAs 由多聚免疫球蛋白受体 (pIgR) 作为二聚体和更高阶聚合物在上皮细胞中输送。生物技术的主要焦点是设计针对疾病相关组织的抗体，而治疗性 IgAs 可以使其递送到传统 IgG 型治疗所无法到达的粘膜组织。

Cryo-EM structure of dimeric sIgA1, tetrameric and pentameric sIgA2m2.
二聚体 sIgA1（左）、四聚体（中）和五聚体 sIgA2m2（右）的冷冻电镜结构。图中所示为覆盖了模型的透明图。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-entry 6ue7（二聚体）、6ue8（四聚体）和 6ue9（五聚体）的图像。
Structure of the secretory immunoglobulin A core；N. Kumar 等人，Science 10.1126/science.aaz5807 (2020)。
目标
利用冷冻电镜确定 sIgA-Fc 二聚体、四聚体和五聚体在原子分辨率下的结构，提出 JC 模板 IgA 齐聚的机制，并描述 pIgR 识别。
冷冻电镜的优势
尽管通过其他技术进行了大量研究，但 sIgA 结构仍然难以捉摸。
冷冻电镜实现的 sIgA 详细结构表征成为未来治疗学和疫苗发展的关键。

Genentech：具有治疗性单抗（利妥昔单抗）的复合物内 CD20 的结构

冷冻电镜揭示了具有用于治疗癌症和自身免疫性疾病的单抗的 CD20 结构复合物。

利妥昔单抗（美罗华、瑞图宣）是一种嵌合 IgG1 单克隆抗体，特异性靶向正常和肿瘤性淋巴结细胞上表达的 CD20 表面抗原。利妥昔单抗目前用于治疗滤泡性和侵袭性这两种 B 细胞非霍奇金淋巴瘤。尽管已证实临床有效，但利妥昔单抗的体内机制仍然不明，可能因淋巴瘤亚型不同而出现差异，产生有害副作用。

CD20: rituximab complex by cryo-EM.
CD20：冷冻电镜下的利妥昔单抗复合物。结构细节揭示了糖薯蓣皂苷元 (GDN) 胶束中 CD20、一种 B 细胞膜蛋白二聚体以及两个 Fab 片段（紫色为重链，粉色为轻链）之间的相互作用。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-entry 6vja 的图像。
Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab；L. Rougé 等人，Science 10.1126/science.aaz9356 (2020)。
目标
通过冷冻电镜确定具有单抗的未知 CD20 结构复合物，以改善对恶性肿瘤和自身免疫性疾病的治疗效果。
冷冻电镜的优势
冷冻电镜为 CD20 作为经过临床验证靶标前所未知的结构和功能提供了新的见解。
冷冻电镜实现的对抗体与受体结合模式的解码，是发现和开发更高效抗体靶向药物的关键。

Merck：胰岛素受体（胰岛素复合物）的冷冻电镜结构

胰岛素受体（胰岛素复合物）的冷冻电镜结构使开发更有效的疗法成为可能。

胰岛素受体 (IR) 是一种二聚体蛋白，在控制葡萄糖稳态、调节脂质、蛋白质和碳水化合物代谢、调节脑神经递质水平方面发挥着关键作用。IR 功能障碍与许多疾病有关，包括糖尿病、癌症和阿尔茨海默病。直到最近，胰岛素与其受体的结合模式依然不明。

Electron density map obtained from cryo-EM (wireframe).
从冷冻电镜获得的电子密度图（线框图）。相应的受体-胰岛素复合物结构会被覆盖。在胰岛素为彩色叠加、胰岛素结构为灰色的复合物内胰岛素受体的结构。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-entry 6ce9 的图像。
Structure of the insulin receptor–insulin complex by single-particle cryo-EM analysis；Scapin, G 等人，Nature 556，第 122-125 页，2018 年 4 月 5 日。
目标
确定胰岛素受体-胰岛素复合物的冷冻电镜结构，有助于了解其结合机制，从而开发出更有效的疗法。
冷冻电镜的优势
单粒子分析 (SPA) 能够精确地确定胰岛素与胰岛素受体之间的相互作用，从而为药物发现开辟新的途径。
FBDD

Astix：利用冷冻电镜进行基于片段的药物发现 (FBDD)

用于 FBDD 的冷冻电镜正在对制药行业产生变革性影响。

根据内部方法开发回顾了冷冻电镜在基于片段的药物发现 (FBDD) 领域的应用。冷冻电镜可以足够的分辨率揭示片段和蛋白质之间分子相互作用的细节。当前可重现性、质量和吞吐量与 FBDD 兼容。解析了肿瘤靶标 PKM2 的第一个冷冻电镜结构。

Cryo-EM structure of the oncology target PKM2.
肿瘤靶标 PKM2、丙酮酸激酶 2 (PKM2) 和结合配体的第一个冷冻电镜结构。PKM2 在肿瘤细胞中显著上调，使其成为肿瘤药物发现的一个潜在靶标。
Fragment-based drug discovery using cryo-EM；Saur, D.T.D. 等人，Drug Discovery Today (2019)。
目标
证明冷冻电镜可用于基于结构的药物设计，并具有支持基于片段 (FBDD) 筛选所需的吞吐量。
冷冻电镜的优势
X 射线晶体学要求蛋白质结晶，对于膜蛋白和多蛋白复合物等靶类，这是无法实现的。
冷冻电镜图可用于基于结构的药物设计。
冷冻电镜见解补充了 X 射线晶体学。

生物制剂

抗体

Amgen：冷冻电镜阐明了抗肿瘤抗体的协同活性

冷冻电镜结构对于开发有效的双特异性抗体至关重要。

人表皮生长因子受体 2 (HER2) 在 20-30% 的乳腺癌肿瘤中过度表达，并与更具侵袭性的疾病、更高的复发率和更高的死亡率有关。曲妥单抗和帕妥珠单抗是 HER2 受体阻滞剂，已成为治疗 HER2 阳性乳腺癌的标准治疗药物。在 HER2 阳性乳腺癌的治疗方案中加入这些单克隆抗体改变了这种癌症的治疗模式。其协同活性的有效性已经在研究以及临床实践中得到了充分验证。

Amgen: Cryo-EM clarifies synergistic activity of anti-tumor antibodies
HER2-曲妥单抗-帕妥珠单抗的冷冻电镜结构。HER2（蓝-绿-红）、曲妥单抗 Fab（品红色）和帕妥珠单抗 Fab（橙色）。曲妥单抗和帕妥珠单抗之间未呈现任何相互作用。Hans Raaijmakers 用 CCP4mg 创建了 PDB-Entry 6OGE 的图像。
HER2-曲妥单抗-帕妥珠单抗复合物的冷冻电镜结构；Hao Y、Yu X、Bai Y、McBride HJ、Huang X (2019)，PLoS ONE 14(5): e0216095，出版日期：2019 年 5 月 1 日。
目标
获得对三元复合物 HER2-曲妥单抗-帕妥珠单抗协同活性的结构性见解。
冷冻电镜的优势
有助于更充分地理解协同活性。
设计具有潜在更高临床功效的双特异性分子的关键见解。
冷冻电镜见解补充了 X 射线晶体学。

Novartis：冷冻电镜实现抗多瘤病毒开发抗体筛选

冷冻电镜揭示了病毒表位的结构，使开发新疗法成为可能。

人类多瘤病毒（BK 和 JC）是导致儿童期肾脏常见持续性感染的原因。这种潜伏性感染的临床表现微乎其微。然而，病毒会在免疫缺陷的情况下重新激活，引起肾病和出血性膀胱炎。开发了一种新的高通量功能性抗体筛选来检查对多瘤病毒的反应。这种方法可以分离出中和 BK 和 JC 病毒亚型的单克隆抗体。

Novartis: Cryo-EM enables development antibody screen against polyomaviruses
具有单链抗体的复合物内 BK 多瘤病毒样颗粒的冷冻电镜结构。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-Entry 6GG0 的图像。
Human Memory B Cells Harbor Diverse Cross-Neutralizing Antibodies against BK and JC polyomaviruses；Lindner 等人，2019，Immunity 50，668–676，2019，出版日期：2019 年 2 月 26 日。
目标
确定病毒衣壳蛋白的复合物结合位点，由于复合物的四级结构，这通过结晶学方法无法实现。
冷冻电镜的优势
冷冻电镜揭示了病毒表位的四级性，并揭示了抑制肾移植受者和其他免疫功能低下患者多瘤病毒感染的有效途径。

Novartis 生物医学研究所：C5 补体蛋白的小分子抑制剂

冷冻电镜使开发新型小分子抑制剂成为可能。

阵发性夜间血红蛋白尿症 (PNH) 是一种罕见的获得性危及生命的疾病，可导致所有血细胞过早死亡。人补体成分 5 蛋白 (C5) 是抗 C5 抗体批准疗法中经验证的药物靶标（Alexion 制造的依库珠单抗）。

Atomic-resolution model derived from cryo-EM structure in the presence of bound inhibitor.
存在结合抑制剂情况下冷冻电镜结构衍生的原子分辨模型。左：C5-眼镜蛇毒因子 (CVF) 复合物在 3.35 Å 分辨率下的冷冻电镜结构。补体 C5 α 链为绿色，β 链为橙色，眼镜蛇毒因子为灰色，抑制剂为蓝色。右：结合抑制剂的电子显微镜密度图（蓝色网格），结合位点残基显示为绿条。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-Entry 6i2x 的图像。
A small-molecule inhibitor of C5 complement protein；Keith Jendza 等人，Nature Chemical Biology，VOL 15，666–668，2019 年 7 月。
目标
获得用于开发更有效新疗法的第一个 C5 补体蛋白小分子抑制剂。
冷冻电镜的优势
确定并优化了第一个 C5 补体蛋白小分子抑制剂的作用机制。
生长适合 X 射线晶体学的晶体不成功。必须在实验中使用冷冻电镜来缩小结合区。
核糖体

Pfizer：类药物分子对核糖体新生链复合物的延宕作用

冷冻电镜阐明了小分子延宕核糖体是如何开启新的治疗策略的。

利用小分子抑制蛋白质合成以选择性地延宕核糖体是一种新的疗法开发策略。被类药物分子 PF846 延宕的人核糖体新生链 (RNC) 复合物的结构会通过一种未知机制选择性地阻断少量蛋白质的转译。结果表明，PF846 结合在核糖体出口通道，并改变新生多肽链的路径。

Cryo-EM structure of the stalled RNC showing ribosome
显示核糖体的延宕 RNC 冷冻电镜结构，40S 为浅蓝色，60S 为灰色，mRNA 为红色，tRNA 为蓝绿色，新生链为洋红色，抑制剂为蓝色。Hans Raaijmakers 用 Pymol 创建了 PDB-Entry 6ole 的图像。
Structural basis for selective stalling of human ribosome nascent chain complexes by a drug-like molecule；Wenfei Li 等人，Nature Structural & Molecular Biology，Vol 26，501-509，出版日期：2019 年 6 月。
目标
确定 RNC 复合物的结构。
冷冻电镜的优势
高分辨率冷冻电镜结构揭示了小分子如何选择性地延宕人类核糖体的转译。
开发治疗性小分子抑制剂的结构基础。
核糖体复合物由于其大小、复杂性和构象灵活性，难以通过 X 射线晶体学进行研究。

关注焦点

向我们的协作者学习如何制备理想的 GPCR 冷冻电镜标本。这一稳健的工作流程为实 现GPCR 的 2.5A 以下重建提供了高成功率。

了解部署了 GeneArt Gene-to-Protein、Thermo Scientific iSPA Workflow 以及 Schrödinger Drug Discovery 平台的赛默飞世尔科技和 Schrödinger 研究团队所采用的基于结构的药物设计方法。

 

 
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