感染的 293T-ACE2 细胞中 SARS-CoV-2 核蛋白染色

(A) 未感染细胞及 (B) 感染 SARS-CoV-2 的 293T-ACE2 细胞在感染 36 小时后，MOI 为 0.1。采用标准实验方案制备细胞，并使用 SARS 冠状病毒核蛋白单抗（克隆号：1C7C7）和 PE 标记的抗小鼠二抗（货号 P852）。使用配备自动进样器的 Attune NxT 流式细胞仪进行数据采集。在 FCS Express 7 中进行数据分析。

检测同一细胞中表达的多种荧光蛋白

使用 Lipofectamine 3000 转染试剂，通过依次转染每个质粒（上图），或将两个质粒 1:1 (w/w) 混合（下图）共转染的方式，将两个质粒转染至 293FT 细胞。转染细胞生长 48 小时后，收集细胞并上流式细胞仪进行分析。用 Attune NxT 流式细胞仪以 100 μL/分钟的流速获取样本，每个样本采集至少 15,000 个细胞。检测所有主要细胞群：表达一种荧光蛋白的细胞、同时表达两种荧光蛋白的细胞和未表达荧光蛋白的细胞（图中显示百分比）。很容易区分表达荧光蛋白的细胞与未表达荧光蛋白的细胞。(A) 分别使用 405 nm 和 561 nm 激光器激发 TagBFP 和 mOrange2。(B) 分别使用 405 nm 和 561 nm 激光器激发 TagBFP 和 mKate。(C) 分别使用 488 nm 和 561 nm 激光器激发 emGFP 和 mKate。

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利用 Attune NxT 流式细胞仪进行荧光蛋白检测

人 PBMC 在 TCR α/β、B2M 和 PD-1 位点蛋白敲低的叠加流式图

培养的人外周血单个核细胞（PBMCs），使用 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 试剂盒激活 T 细胞。然后使用 Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA、TrueCut Cas9 Protein v2 和 Invitrogen Neon 电转染系统对细胞进行基因编辑。利用 Invitrogen TrueDesign Genome Editor 工具设计针对人 T 细胞受体、β-2 微球蛋白和 CD47 基因的 gRNA。转染 72 小时后，分别使用流式细胞仪、二代测序、Sanger 测序分析和基因组切割实验检测细胞的编辑效率。所有图表和数据分析均来自于Attune NxT 软件。每个直方图都与未经Neon电转染的细胞对照进行叠加，每个图表均来自于单个板孔采集的数据。所用流式抗体分别是 TCR α/β (IP26) PE (eBioscience)、β-2 Microglobulin (B2M-01) FITC 和 CD279 (PD-1) (eBioJ105 (J105)) APC-eFluor 780 (eBioscience)。

多个位点蛋白敲低效率的筛选

培养的人外周血单个核细胞 (PBMCs)，使用 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 试剂盒激活 T 细胞。然后使用 Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA、TrueCut Cas9 Protein v2 和 Invitrogen Neon 电转染系统对细胞进行基因编辑。利用 Invitrogen TrueDesign Genome Editor 工具设计针对人 T 细胞受体、β-2 微球蛋白和 CD47 基因的 gRNA。转染 72 小时后，使用流式细胞术分析每个位点的功能性蛋白敲低效果，从而分析细胞的编辑效率。在 Attune NxT 流式细胞仪和 CytKick 自动进样器上获取样本。以上叠加图由 Attune 流式软件生成。每个直方图都与未转染对照进行叠加。所用单克隆抗体分别是 TCR α/β (IP26) PE (eBioscience)、β-2 Microglobulin (B2M-01) FITC 和 CD279 (PD-1) (eBioJ105 (J105)) APC-eFluor 780 (eBioscience)。

使用 Attune 流式软件检测基因编辑细胞的设门策略和数据分析

对不同样本孔中的单个活细胞进行蛋白表达分析，以未转染的样本为阴性对照，设门分析蛋白敲低的效率。使用布尔逻辑公式 (NOT "B2M+") AND (NOT "CD47+") AND (NOT "TRAC+") AND "Singlets" AND "Cells" 设一个衍生门（三基因敲除），来确定多重CRISPR 蛋白敲低细胞的比例。

在 TCR α/β、PD-1 和 B2M 三个位点进行基因编辑的细胞比例

图中显示所有细胞，反向设门为红色的表示“三基因敲除”细胞亚群。利用 Attune NxT 流式图的统计功能确定 3 个位点的蛋白敲低比例约为 38.7%。

检测 PBMC 中稀有的 ILC2 细胞亚群

(A) 用 100 μL PBS (+10% FBS) 重悬 1 x 10⁶ 个 PBMC 细胞。用Invitrogen FITC标记的预混白细胞谱系标志物（lineage cocktail，包含CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD56 和 CD235a）、CD123-FITC 和 CRTH2-Alexa Fluor 647流式抗体进行染色。ILC2 细胞被定义为 lineage (BL1) 阴性，CRTh2 (RL1) 阳性细胞群。(B) CRTH2 细胞是一类在 Th2 细胞上表达趋化受体同源分子的细胞。CRTH2 分子是与一种异源三聚体 G 蛋白偶联的七重跨膜蛋白，也是前列腺素 D2 受体，主要在 Th2 细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞上表达。CD294分子可抑制Th2 细胞凋亡，并介导表达CRTH2的细胞向过敏性炎症部位（例如哮喘肺）的趋化作用。(C) ILC2 细胞的表型为 lineage 阴性和 CRTH2 阳性。在本例中，ILC2细胞亚群仅占淋巴细胞的0.016%。数据由莱斯特大学的 David Cousins 提供。

采用染色/裂解方案对染色的人全血样本进行 13 色免疫表型分析的设门策略

按照 Attune NxT 流式细胞仪的应用文档对人全血细胞进行染色和采集分析。(A) 分析中通过对点图中的活细胞（碘化丙啶^-）进行设门，从而排除死细胞。(B) CD45⁺ 通过设门从裂解全血细胞中选择白细胞群。(C) 根据前向角散射光和侧向角散射光点图分别圈出淋巴细胞和单核细胞。(D) 在散射光点图中，单核细胞的位置高于淋巴细胞，且表达 CD14 和 CD33。(F) 在淋巴细胞门内，免疫细胞可根据其表达 CD3 （T 细胞）、CD19（B 细胞）或二者均不表达（NK 细胞）而进一步区分不同亚型。(E) B 细胞可通过 HLA-DR 和 CD45RA 的表达情况进一步分析不同亚群。(G) T 细胞可进一步分为 CD4⁺（辅助性 T 细胞）和 CD8⁺（细胞毒性 T 细胞）亚群，而 (J) 调节性 T 细胞可表达 CD4 和 CD25。(H, K) CD62L 识别初始细胞 (TN) CD4 和 CD8 T 细胞，而 HLA-DR 由活化 T 细胞 (TA) 表达。(I) 最后，NK 细胞不表达 B 细胞和 T 细胞标志物 (CD19–CD3–)，但表达 CD56。

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可使用 Attune NxT 流式细胞仪对人裂解全血中的 B 细胞、NK 细胞、多种 T 细胞亚群和髓系细胞进行 13 色免疫表型分析

数据是使用 532 nm 激光器从植物细胞核中采集的，这些细胞核取自拟南芥 Col-1 叶片组织且用 FxCycle PI/RNase 染色液进行标记。(A) 用侧向散射光与 FxCycle PI/RNase 荧光数据绘制的双参数密度图，发荧光细胞核周围为散射光门。(B) 使用对单体细胞核进行设门的 FxCycle PI/RNase 荧光数据绘制的双参数密度图。(C) 用细胞核设门的细胞群的 FxCycle PI/RNase 荧光数据绘制的对数直方图，不同的峰分别对应 2C、4C、8C 和 16C 细胞核。

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利用双激光（488 nm 蓝激光和 405 nm 紫激光）SSC 信号检测全血样本（免洗免裂解）。

(A, B) 仅通过蓝激光和紫激光 SSC 两个散射光信号就可以很好地区分红细胞 (RBC)、白细胞 (WBC) 和血小板。红细胞中的血红蛋白具有吸收 405 nm 紫色光线的特性，相对于白细胞和血小板，红细胞由于吸收了 405 nm 的光信号，所以其紫激光侧向角散射光信号（V-SSC）变低，红细胞群会右移。为了确保血小板群可以完整可见，需要将 FSC 和 SSC 的阈值都设到最低，至出现仪器噪声信号。(C) 使用包含白细胞和血小板的门，在 FSC / 488 nm SSC 点图中可以区分血小板和白细胞两个细胞群，并分别进行设门。(D) 在图 (A) 中利用颜色反向设门，使得红细胞群显示为红色，血小板细胞群为绿色，白细胞群为蓝色，而噪音信号为黑色。而白细胞又可以分成 3 个主要的细胞亚群，分别是淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。(E) 分别对红细胞、白细胞和血小板三群细胞进行圈门，可以看出红细胞在全血中占主导地位，而白细胞和血小板的数量相对稀少。

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针对心肌细胞分化过程中转录因子的流式细胞分析。

反映 H9 hPSC 细胞向心肌细胞分化过程中 Oct4 和 Nkx2.5 表达情况的双参数散点图。所有流式图显示的都是单个细胞门。(A) 培养第 1 天，几乎所有细胞都是 Oct4⁺ 和 Nkx2.5^–，细胞呈多能分化状态。(B–J) 在分化过程中，随着时间的推移，细胞表达 Oct4 的水平逐渐降低，并开始表达心肌标记物 Nkx2.5。如上图所示，红色细胞群代表 Nkx2.5⁺ 细胞，绿色细胞群代表 Oct4⁺ 细胞。

抗原特异性循环 CD4 T 细胞五色基础配色方案。

上图显示的是来自健康供者未稀释的全血样本分别在 (A) 无抗原刺激或 (B) 用结核分枝杆菌 PPD 或 (C) 用 CMV 细胞裂解液刺激培养 24 小时后 CD69 和 CD137 的表达情况。然后收集培养的细胞，利用基础配色方案抗体（包括 CD137、CD69、CD3、CD4、CD19、CD16 和 CD14）和死活染料 (LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain) 进行染色，并在 Attune NxT 流式细胞仪上进行采集和分析。(D) 利用散射光信号对淋巴细胞设门，然后对 (E) 单细胞设门，接着分析 (F, G) dump 通道^– CD3⁺ CD4⁺ 细胞。

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