抗体对于蛋白免疫印迹实验的成功至关重要。它们允许选择性地检测目的蛋白质。通常情况下，一抗用于特异性地结合目的蛋白，而标记的二抗则用来进行信号放大并最终检测信号。

多克隆和单克隆抗体都适用于蛋白免疫印迹实验。多克隆抗体生产成本较低且耗时较少，而且它们通常对抗原具有高亲和力。单克隆抗体的价值在于其特异性、纯度和一致性可导致较低的背景。多克隆和单克隆抗体是使用小鼠、大鼠、兔、山羊和其他动物种属为宿主开发的。粗制抗体试剂如血清或腹水有时用于蛋白免疫印迹实验，但由于杂质的存在可能会导致背景的增加。

一抗通常在使用前需要从储备浓度稀释，并且每种抗体需要一些优化以达到最佳效果（请务必查看产品数据表中的推荐稀释度）。将转印有蛋白的膜与一抗溶液一起孵育后，洗涤，如果一抗没有标记染料或分子等，则加入标记的二抗或其他第二级检测试剂。

一抗也可用于检测蛋白免疫印迹实验中的内参对照。内参对照抗体有助于评估蛋白免疫印迹的效率，并比较凝胶中每个孔中蛋白的加样量。这些对照有助于确定样本间表达水平的差异是由实际蛋白水平还是由加样量差异引起的。

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二抗可以与许多不同的分子结合用于检测，例如酶、荧光团和染料。最常见二抗结合物是辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。荧光标记的二抗，如我们选择的Alexa Fluor 抗体，也越来越受欢迎。基于荧光的检测提供了与化学发光检测相似的灵敏度，但它允许同时检测多个荧光基团，以提供两种或更多不同蛋白的比较数据。

与使用标记的一抗相比，使用二抗可以大大提高灵敏度。直接标记的一抗通常每个抗体上只有少量的标记物。二抗的设计使其可与一抗的多个位点结合，从而导致多个二抗分子可同时与一个一抗分子结合。这导致标记分子或酶的数量增加了 3 到 5 倍，信号显著放大。

二抗通常在使用前需要从其储备浓度稀释，并且每种抗体需要一些优化以达到最佳效果（请务必查看产品数据表中的推荐稀释度）。将转印有蛋白的膜并与一抗先孵育过的膜与二抗溶液一起孵育后，洗涤，再孵育底物以显示条带。

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图 1.蛋白免疫印迹中的兔 IgG (H+L) 二抗使用兔抗 MEK2 Abfinity 单克隆一抗和Alexa Fluor 790 标记的山羊抗兔 IgG (H+L) Superclonal 二抗检测内源性 MEK2（左）。对照印迹（右）未经一抗处理以证明二抗无交叉反应性。采用 XCell-Surelock 电泳系统和 iBlot 干印迹系统对 HeLa、人宫颈癌、细胞（通道1-5）的全细胞提取物进行蛋白免疫印迹分析。