说明和流程概述
本实验方案使用 TRI 试剂和二氧化硅过滤器,从 LeukoLOCK™ 白细胞去除过滤器(Ambion 货号1933)捕获的白细胞中分离总 RNA。调整用于将 RNA 与二氧化硅过滤器相结合的乙醇量,可决定是回收包括小 RNA 组分的总 RNA,还是回收已去除 microRNA (miRNA)、tRNA 和 5S/5.8SrRNA 等较小组分的 RNA。使用此实验方案回收的 RNA 的质量和纯度与使用 LeukoLOCK 总 RNA 分离系统(货号1923)观察到的结果相似,并且得率通常增加约 50%–100%。尚未使用通过此实验方案提取的 RNA 进行微阵列实验,但是如果在血液过滤后立即用 RNAlater 处理捕获的白细胞,预计 RNA 谱不会发生改变。
试剂/用品
- TRI 试剂(例如,Ambion 货号9738)
- LeukoLOCK 分离和稳定试剂盒,Ambion 货号1933
- 变性裂解液,Ambion 货号 8540G (100 ml)
- 无核酸酶水(例如,Ambion 货号9938、9930)
- 无核酸酶的 0.1 mM EDTA(例如,Ambion 货号9912,50 ml)
- 5 M 氯化钠(例如,Ambion 货号9759、9760G)
- 溴-3-氯丙烷 (BCP)(例如,Sigma 货号 B-9673 或 MRC 货号 BP151)
- 100% 乙醇,ACS 试剂级或同等纯度
- 离心柱,Ambion 货号 10051G(50个/包);
- 洗脱管,Ambion 货号12480(100支/盒)
- 15 ml 一次性带盖锥形塑料管(例如,Ambion 货号12500)
- 无核酸酶的微量移液器吸头和微量离心管(例如,Ambion 货号12400、12648)
- (可选)DNAfree™ 试剂盒,Ambion 货号1906(50次反应/盒)
其他用品
- 含 EDTA 抗凝剂的采血管;我们推荐 9 ml Vacuette EDTA K3 (Greiner Bio-One #455036) 或 Venosafe EDTA K3 (Terumo #VF-109SDK)。这些管盖带有薄隔垫,比塞型管盖更容易刺穿。
- 10 ml 真空采血管,提供真空源并用作 LeukoLOCK 过滤器滤出液的接收管;推荐 10 ml 真空采血管 BD #366430 或 Terumo Venoject #VT-100SP
- 25 G x 5/8 英寸皮下注射针头(例如,BD #305122)和 ~16 G 皮下注射针头
- 5 ml 注射器
- 一次性塑料移液管(5 或 10 ml)和球形或机械移液器
制备洗涤液1
根据下表制备洗涤液1(足够用于约65次制备)。在密闭容器中室温储存。
制备洗涤液2/3
根据下表制备洗涤液2/3(足够用于约65次制备)。在密闭容器中
室温储存。
预热无核酸酶的 0.1 mM EDTA 至 80°C
将无核酸酶的 0.1 mM EDTA 等分试样放入无核酸酶的试管中,在加热模块加热至 80°C;其将用于在程序结束时从步骤 E.10 的离心柱中洗脱 RNA。通常用 250 μl 洗脱样本。请勿在不粘管中加热。
根据下表制备洗涤液1(足够用于约65次制备)。在密闭容器中室温储存。
组成 | 制备 50 ml | 组分 |
---|---|---|
30% | 15 ml | 变性裂解液(Ambion 货号 8540G) |
70% | 35 ml | 100% 乙醇 |
制备洗涤液2/3
根据下表制备洗涤液2/3(足够用于约65次制备)。在密闭容器中
室温储存。
组成 | 制备 100 ml | 组分 |
---|---|---|
80% | 80 ml | 100% 乙醇 |
19 ml | 无核酸酶水 | |
50 mM | 1 ml | 5 M NaCl |
预热无核酸酶的 0.1 mM EDTA 至 80°C
将无核酸酶的 0.1 mM EDTA 等分试样放入无核酸酶的试管中,在加热模块加热至 80°C;其将用于在程序结束时从步骤 E.10 的离心柱中洗脱 RNA。通常用 250 μl 洗脱样本。请勿在不粘管中加热。
- 采集血样,并通过 LeukoLOCK 过滤器捕获白细胞
- (可选)用 3 ml PBS 冲洗过滤器
为去除 LeukoLOCK 过滤器上捕获的红细胞和网织红细胞,请按照 LeukoLOCK RNA 分离系统方案的步骤 II.B.4,用 3 ml 1 X PBS 冲洗。 - (推荐)用 3 ml RNAlater 冲洗过滤器
为稳定所捕获的白细胞中的 RNA,请按照 LeukoLOCK 总 RNA 分离系统方案的步骤 II.B.4,用 3 ml RNAlater 冲洗过滤器。请勿排出 LeukoLOCK 过滤器中的残留 RNAlater,并且在取下注射器之前,请勿缩回注射器的柱塞。 - 密封 LeukoLOCK 过滤器端口
用 Transfer Spike(液体转移接头)的护套和螺帽密封 LeukoLOCK 过滤器端口。
停止点含稳定白细胞的 LeukoLOCK 过滤器在室温下可储存最长3天,或在 –20°C 或 –80°C 条件下长期保存(数月)。
采集血样,并根据 LeukoLOCK 总 RNA 分离系统方案通过 LeukoLOCK 过滤器捕获白细胞。完成第 II.B 节中的步骤 1-3。样本采集以及白细胞捕获和稳定。(您可以从我们的网站 http://www.ambion.com/catalog/CatNum.php?1923 下载实验方案。)
LeukoLOCK 分离和稳定试剂盒(货号1933)随附的 CD 提供了此过程的视频。
- 去除 LeukoLOCK 过滤器中的 RNAlater
如果含捕获细胞的 LeukoLOCK 过滤器已冷冻储存,则在继续操作前,先在室温下解冻约5分钟。
从 LeukoLOCK 过滤器上取下封盖。将 3 ml 或 5 ml 注射器(柱塞缩回)连接到 LeukoLOCK 过滤器的入口,然后按下柱塞,排出过滤器和端口中的 RNAlater。
通常,从 LeukoLOCK 过滤器中排出约 8-10 滴 RNAlater。 - 用 4 ml TRI 试剂冲洗 LeukoLOCK 过滤器;将裂解物收集到 15 ml 管中
在此步骤中,裂解通过 LeukoLOCK 过滤器捕获的白细胞,然后将裂解物从过滤器中冲洗出并收集到 15 ml 锥形管中。- 在5 ml 注射器中装入 4 ml TRI 试剂。可使用大规格针头提取 TRI 试剂;在继续以下步骤前,将针头从注射器取下。
- 将含有 TRI 试剂的注射器连接到 LeukoLOCK 过滤器的入口(喇叭形),然后按下注射器的柱塞以用 TRI 试剂冲洗过滤器,将裂解物收集到 15 ml 锥形管中。该过程需要 5-10 秒。取下注射器,缩回柱塞,将其重新连接到过滤器上,按下柱塞,将滤盘中滞留的残留样本排出到 15 ml 管中。
- 加入 800 μl BCP,用力振摇30秒,然后将混合物在室温下放置5分钟
- 向裂解物中加入 800 μl BCP,盖上管盖。(或者,也可在步骤 2.b 中收集裂解物之前将 BCP 加入到 15 ml 管中。)
- 盖紧试管并用力振摇制备物30秒。
- 将样本在室温下储存5分钟。
- 以 ~2,000 x g 离心10分钟后回收水相
- 以 ~2,000 x g(注:在 Straight8 或 IEC 台式离心机中相当于 3,200 rpm)离心制备物10分钟。
- 将水相(顶相)移至一支新的 15 ml 锥形管中。预计体积约为 2.5–2.6 ml。
- 加入水/乙醇,用于分离总 RNA 或已去除小 RNA 组分的 RNA
要分离总 RNA(包括小 RNA 组分):
测量水相体积(使用 15 ml 管上的校准标记),加入0.5体积的无核酸酶水并混匀。然后加入1.25体积的 100% 乙醇并再次混匀。例如,如果样本体积为 2.6 ml,则加入 1.3 ml 水,混匀,然后加入 4.9 ml 乙醇并再次混匀。制备物应均一且澄清或仅略微浑浊。要采用无法有效回收小 RNA 组分的条件分离总 RNA:测量水相体积,加入0.5体积的 100% 乙醇并混匀。制备物应澄清。 - 通过离心柱过滤样本
采用真空压力或离心法,通过离心柱(货号 10051G)过滤样本。由于与离心柱容量 (~700 μl) 相比,样本体积较大,因此采用真空压力更简单;下面提供了这两种方法的操作说明。
真空过滤:- 对于每个离心柱,将一支 5 ml 注射器筒连接到真空歧管上的入口。
- 将离心柱插入注射器筒并施加真空。
- 使用 5–10 ml 移液管将制备物加入离心柱中,随着样本通过过滤器,缓慢加入更多样本。过滤所有制备物通常需要 1–2 分钟。
离心:如果真空歧管/真空系统不可用,将离心柱插入洗脱管中,并将 ~700 μl 样本吸移到离心柱中。短暂离心 (~10 sec),以过滤样本,然后弃去滤出液。重复此步骤,以过滤所有样本。 - 用 750 μl 洗涤液1洗涤离心柱
- 将离心柱放入洗脱管中,加入 750 μl 洗涤液1。
- 在设定为最大转速的微量离心机中将离心柱组件离心 ~5-10 秒,或者直至所有溶液通过过滤器。(溶液通常会在离心机达到最大转速之前通过过滤器。)
- 弃去洗脱管中的滤出液,将离心柱放入相同洗脱管中。
- 用2份 750 μl 洗涤液2洗涤离心柱
- 按照前一步骤中所述的方法,用 750 μL 洗涤液2洗涤离心柱。
- 再用 750 μl 洗涤液2重复洗涤一次。
- 离心离心柱以干燥过滤器
- 用 200–250 μl 的预热 0.1 mM EDTA 洗脱 RNA
- 将离心柱放入一支新的洗脱管中。
- 向离心柱中的过滤器中心加入 200–250 μl 无核酸酶的 0.1 mM EDTA(预热至 80°C),盖好盖子,在室温下储存1分钟。
- 以最大转速离心1分钟。RNA 将在洗脱管底部的滤出液中。丢弃离心柱。将洗脱的 RNA 储存在 –20°C 或 –80°C 下。
- (可选)用 DNase 处理洗脱的 RNA
(可选)如果需要,用 DNase 处理洗脱的 RNA,以去除污染性 DNA。我们推荐使用 Ambion 的 DNAfree™ 试剂盒(货号1906),以充分去除基因组 DNA 并简化 DNase 的灭活步骤。
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