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Invitrogen ABfinity組換えウサギモノクローナル抗体のプラットフォームは、リン酸化特異的抗体などの翻訳後修飾に対する抗体の産生に特に有効です。Abfinity抗体の産生プロセスは、ウサギ免疫系の自然多様性を利用しており、マウス内で産生させた抗体より高い親和性と特異性を持つ抗体を産生する傾向があります。また、バイオ製造プロセスが標的とするリン酸化状態を認識できる単一のクローンを同定します。ABfinity抗体は、ポリクローナル抗体の安定性とモノクローナル抗体の特異性を組み合わせています。さらに、ABfinity抗体は組換え体であるため、抗体の性能はロット間で一貫しており、その後の動物への免疫化が不要で、クローンドリフトの恐れもありません。
現在、700を超えるABfinity組換えウサギ抗体が存在し、このうち100以上が特定のリン酸化のために開発されています。ウサギモノクローナル抗体の他に、弊社は組換えポリクローナル抗体であるABfinityオリゴクローナル抗体を産生しています。これらの抗体は、ポリクローナル抗体に見られる様々な結合特性、ならびに組換え抗体だけに見られるロット間の再現性をもたらすよう設計されています。
全てのABfinity抗体は、製造中に数回のスクリーニングが実施されます。これにより、目的の用途における性能が実証されたクローンを同定することができます。最後に可能な場合、活性化されたターゲット上の抗体を試験し、特定のリン酸化に対する抗体の特異性を確認します。
産生方法と産生過程でのサンプルスクリーニング、更には性能試験を組み合わせることで、ABfinityリン特異的抗体は、細胞内の重要なリン酸化を調べるための非常に特異的で高感度なツールになります。
phospho-4E-BP1（Thr46）抗体の性能特性。4E-BP1 [pT46]のウェスタンブロット分析を、以下のサンプルの細胞溶解物におけるタンパク質のそれぞれ30μgについて実施しました：レーン 1、HEK 293；レーン 2、 100nmol / mLのEGFで10分間処理したHEK 293；レーン 3、MCF7；レーン 4、150μg/ mLのインスリンで15分間処理したMCF7 。Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris gel、XCell SureLock Electrophoresis System、Sharp Prestained Protein Standard、および iBlot Dry Blotting System をタンパク質電気泳動およびブロッティングに使用しました。タンパク質をニトロセルロース膜に転写し、5％スキムミルクで室温で1時間ブロックしました。4E-BP1 [pT46]が~20 kDa 検出されました。ABfinity 4E-BP1 [pT46] Recombinant Rabbit Oligoclonal Antibodyを1〜2μg/ mL使用し、2.5％のスキムミルク中で4°Cで一晩、ロッキングプラットフォーム上で検出しました。 1：5,000希釈のGoat Anti–Rabbit IgG HRP Secondary Antibodyを用いて、Novex ECL Chemiluminescent Substrate Reagent Kitで化学発光検出を行いました。
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弊社の各リン酸化特異的フローサイトメトリー抗体および関連バッファーは様々な性能試験の対象となっています。弊社の目標は全 フローサイトメトリー実験において、抗体が期待された性能を発揮することを研究者に信用していただくことです。
eBioscienceおよび競合クローンを用いたパスウェイ特異的試験。U937細胞を指示に従い処理し、抗リン酸化STAT6抗体、APCを用いて細胞内染色を行いました。赤色スペクトルは未処理の細胞、青色スペクトルは処理した細胞です。
詳細は Phospho Flow Cytometry Antibody Validationを参照下さい。
抗体の特異性や利用法の検証方法を標準化するための国際的ワーキンググループ、International Working Group on Antibody Validation (IWGAV) は、抗体の特異性を検証するための一連のガイドラインを発表しました：
アプリケーション試験は抗体が特定のアプリケーションで機能することを検証しますが、性能テストは抗体が目的とするターゲットに実際に結合するかを検証します。
このガイドラインではいくつかの「ピラー（柱）」が紹介されており、それぞれ、目的のターゲットへの抗体の結合を検証する手法となっています。免疫沈降 - 質量分析ピラー（IP-MS）は、免疫沈降で捕捉されたタンパク質に特異的なペプチド配列を、実際に表示するという独特な試験方法です。（こちらのIP-MSを参照下さい）。ノックアウトおよびノックダウン法による遺伝子組換えは、特定の遺伝子の量を減少させることによって特定のタンパク質を排除して特異性を検証します。マルチプルエピトープ法は、同じ標的上の異なるエピトープに対する抗体を利用して、両方の抗体の特異性を検証します。
IWGAVは、タンパク質研究の分野において様々な研究に関心を持つ国際的な研究者による独立したグループです。IWGAVは、抗体性能試験における規模と範囲について、抗体生産者とユーザーの両方に対して重要な提言をしてきました。サイエンスに携わる世界的リーダーであるサーモフィッシャーサイエンティフィックは2015年、IWGAVに経済的支援を提供し、業界標準の開発を率先し、抗体の特異性と再現性における共通の課題に取り組みました。
詳細はIP-MS および knockout/knockdown 性能試験をご覧下さい。
研究抗体は革新と発見には重要ですが、特性の低い試薬の使用は生体医科学の厳密さや再現性を阻害する場合があります。International Working Group on Antibody Validationは、抗体性能試験のガイドラインを提供することでこの問題に取り組んでいます。これらのガイドラインに沿って、サーモフィッシャーサイエンティフィックは抗体性能の基準の再定義に取り組んでいます。新たに提案された抗体性能試験の概念的なピラーに従い、一連のInvitrogen抗体の特異性を試験し、また弊社の抗体の性能試験データを幅広く提供しています。標的タンパク質により決まる生物学的手法やエピトープマッピング、抗体シーケンシングの他に、IP-MSやCRISPR、siRNAを用いて抗体を試験するための開発が既に始まっています。またマルチプルプラットフォームでの幅広いアプリケーション性能試験を提供しています。弊社の製品詳細ページより、標的特異性とアプリケーションの両方に関する広範なデータが閲覧でき、ご希望の実験アプリケーションにおいてInvitrogen抗体が優れた性能を発揮することを確認いただけます。
広範囲に性能試験された抗体の例を参照してください
弊社の様々な全 Invitrogen 抗体について、thermofisher.com/antibodiesから検索してさい。
Invitrogen eBioscience Super Bright色素はバイオレットレーザー（405 nm）で励起されるポリマーとそのタンデムをベースにした明るい蛍光色素です。全ての Super Bright フォーマットには発光波長の名前が付けられています。これらの色素はフローサイトメトリーでの使用に最適化されており、暗い細胞集団も良好に識別できるほど鮮明です。一部の色素では、他の紫色系への漏れ込みが減少しました。または競合試薬と比較して、他のポリマー色素との非特異的相互作用が少なくなりました。
他に一般に使用されている蛍光分子やホルムアルデヒドやメタノールベースの固定液、またInvitrogen UltraComp eBeads微粒子と完全に適合し、Super Brightコンジュゲートはフローサイトメトリーのマルチカラー抗体パネルデザインを最適化します。
Super Bright 色素は従来の蛍光標識色素と同様、フローサイトメトリーアプリケーションで使用可能です。しかし、2つ以上のSuper Brightコンジュゲート抗体を同じパネルに混合する場合、ポリマーベースの色素間で起こりうる非特異的相互作用を最小限に抑えるため、Super Bright Staining Bufferの使用を推奨します。Super Bright Staining Bufferは1回の試験につき5μL使用できるように調製されており、マスターミックスやカクテルでの使用に便利です。
Super Bright 色素によりマルチカラーパネルデザインのオプションが増え、バイオレットレーザーの実用性が増します。Super Bright抗体コンジュゲートは、待ち望まれていたユーザーフレンドリーな代替品です。
10色のT細胞サブセットパネル。ヒト末梢血細胞をSuper Bright Staining Buffer中で等分し、指定試薬で表面染色しました。次に、サンプルをFoxp3/Transcription Factor バッファーセットプロトコルに従って固定・透過処理し、指定の細胞内試薬で染色しました。解析により様々なT細胞亜集団を識別しました。
細胞イメージングおよび蛍光ベースのウェスタンブロッティングの実施時に、貴重なサンプルを重要な実験に使用するにはリスクがあります。しかし現在、優れた輝度と光安定性が期待できる、独自の「Plus」色素化学を用いた専用試薬であるInvitrogen Alexa Fluor色素がコンジュゲートされた二次抗体が入手可能です。この独自の色素化学が高い予備吸着性を持つことで、Alexa Fluor Plus二次抗体は高いシグナル対ノイズ比および優れた輝度をもたらします。
目に見える違いを確認下さい：
Invitrogen Alexa Fluor Plus 488二次抗体により、より詳細な識別と、またより高いシグナル対ノイズ比が得られます。コンジュゲートの比較：(A) Alexa Fluor 488 二次抗体と(B) 新しいAlexa Fluor Plus 488 二次抗体の比較。
Thermofisher.comの新しいリソース！新しく開設されたAntibodies Learning Centerには、研究を進めるうえでの抗体の開発、選択、使用に必要な抗体技術に関する背景知識を、研究者や技術者に提供するための教育資料が含まれています。
この新しいリソースセンターは、細胞シグナル伝達経路、抗体の実験法、アプリケーションノートおよび関連リソースライブラリを含む貴重な情報を提供します。
BioProbes—Molecular Probes Journal of Cell Biology Applications
は、様々なThermo Scientific、Invitrogenの細胞生物学製品およびアプリケーションを紹介する、年に2回の刊行物です。74版ではCRISPR、幹細胞研究、神経科学、イメージング、フローサイトメトリーに関する記事を掲載しています。
2016年4月、Affymetrixの買収と共に、eBioscience社はThermo Fisher Scientificの一員となりました。現在、ウェブサイトが統合され、eBioscienceの試薬はthermofisher.comで入手できます。免疫学、腫瘍学、細胞生物学、および幹細胞生物学の研究に最適な、抗体、蛍光色素、マルチカラーフローサイトメトリー用の様々な革新的な製品を提供しています。
マルチカラーフローサイトメトリー試薬の他に、eBioscienceとInvitrogenの製品を組み合わせて、幅広いスペクトルのサイトカイン、成長因子、および他の可溶性タンパク質の解析用の試薬を提供します。フローサイトメーター、すぐに使用できるELISAキット、抗体ペア、タンパク質、および標準用のビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイを提供し、生物系分析のための完全なソリューションを提供しています。
thermofisher.com/ebioscience より、豊富な細胞分析ソリューションを探して下さい。
