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基礎：RNaseの制御
RNaseとは何か？
RNaseは、RNAの分解において重要な役割を果たす酵素です。 RNaseには、分子内に多数のジスルフィド結合を形成するシステイン残基がいくつか存在します。この酵素の頑強な性質により、多くの除染方法では除去が困難であり、表面や溶液からRNaseを除去するには、強力な化学的方法が必要となることがよくあります。
RNaseは何をするのか？
RNaseはRNAの開裂を触媒し、RNAの分解に寄与します。ヌクレオチド間の結合が切断され、RNAがより小さな成分に分解され、他の酵素へのアクセスが可能になります。RNaseは通常、RNAの完全性とサンプルの品質を低下させるため、研究者がRNAを扱うラボでは汚染物質と見なされます。
RNases in the lab
ラボのRNaseから保護するには、RNAサンプルを適切に保存し、RNase汚染を検出するために日常的に検出されるバッファーや溶液、RNase汚染除去溶液とRNase阻害剤を使用することで、ラボスペースからRNaseを阻害または除去する必要があります。
RNAサンプルにサンプル保存が重要なのはなぜですか？
微量のRNaseが存在すると、サンプルが水性環境で凍結保存されている場合でも、RNAの完全性が損なわれる可能性があります。RNAサンプルの保存のベストプラクティスは以下のとおりです。
短期保管の場合：RNAサンプルは、RNaseフリー水（0.1mM EDTA含有）またはTEバッファー（10mM Tris、1mM EDTA）に再懸濁し、-80℃で保存することができます。キレート剤を含むバッファー溶液を使用するのが、RNAを保存するより良い方法です。Mg2+やCa2+などの2価の陽イオンのキレート化は、熱による鎖の切断を防ぎます（Mg2+の存在下で加熱すると、RNAは化学的に切断されます）。
長期保管の場合：あらかじめ分注したサンプルに塩／アルコール沈殿を行い、核酸をこの溶液中の沈殿として-20℃で保存します。低温とアルコールの存在により、すべての酵素活性が阻害されます。中性pHよりも低い（酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムが存在するため）ことは、RNAの安定化にも役立ちます。ダウンストリームアプリケーションを行う前に、RNAをこの溶液から遠心分離する必要があります。
RNaseの汚染源
RNase汚染の一般的な原因には、ラボベンチ、ピペッター、ガラス器具、チューブ、チップ、電気泳動装置も備えていますRNAを扱う場合、微量遠心機やPCRチューブ、ピペットチップなどのラボ用プラスチック消耗品がRNaseフリーであることを確認することが重要です。ベンチトップ、遠心分離機、電気泳動装置などの実験室の表面はすべて、環境汚染物質にさらされているため、RNaseで汚染されていると推定すべきです。ラボ表面のRNase汚染源には、多くの場合、細菌や真菌の胞子やヒトの皮膚から放出された死細胞（手など）が含まれます。
RNaseのいたるところに存在する性質により、分子生物学アプリケーションで使用される水とバッファーはRNase汚染の原因となることがよくあります。DEPC処理は、水およびバッファー中のRNaseを不活性化するためにもっとも一般的に使用される方法です。ただし、TRISなどの特定の試薬はDEPC処理できません。
RNA鎖の切断
RNAの分解が見られるたびにRNase汚染が最も疑われますが、RNA分子は、Mg2+やCa2+などの二価陽イオンが存在する場合に、>80℃で数分以上加熱されるとストランドの傷を受けることもあります。そのため、RNAの加熱が必要な場合は、キレート剤を使用する必要があります。
Ambionの科学者が推奨するRNase制御のためのスケジュール
Ambionの科学者は、RNase汚染制御の以下のスケジュールを推奨しています。
- 毎日
- RNaseフリーのバッファーおよび試薬を使用してください
- 微量遠心チューブやピペットチップなどのRNaseフリーの消耗品をご使用ください
- in vitro転写やRT-PCRなどの反応には、リボヌクレアーゼ阻害剤タンパク質および／または抗RNaseを使用します
- 毎週
- ラボのベンチトップ、ピペッター、およびチューブラックを徹底的に洗浄します
- 毎月
- RNaseのテスト水源
- 必要に応じて
- RNase用のベンチ調製済み試薬をテストします
- RNAを使用する前に、電気泳動装置を清掃してください
- RNaseの使用を取り入れた手順を行う際には、バリアまたはフィルターピペットチップを使用してください
RNAサンプルにサンプル保存が重要なのはなぜですか？
微量のRNaseが存在すると、サンプルが水性環境で凍結保存されている場合でも、RNAの完全性が損なわれる可能性があります。RNAサンプルの保存のベストプラクティスは以下のとおりです。
短期保管の場合：RNAサンプルは、RNaseフリー水（0.1mM EDTA含有）またはTEバッファー（10mM Tris、1mM EDTA）に再懸濁し、-80℃で保存することができます。キレート剤を含むバッファー溶液を使用するのが、RNAを保存するより良い方法です。Mg2+やCa2+などの2価の陽イオンのキレート化は、熱による鎖の切断を防ぎます（Mg2+の存在下で加熱すると、RNAは化学的に切断されます）。
長期保管の場合：あらかじめ分注したサンプルに塩／アルコール沈殿を行い、核酸をこの溶液中の沈殿として-20℃で保存します。低温とアルコールの存在により、すべての酵素活性が阻害されます。中性pHよりも低い（酢酸ナトリウムまたは酢酸アンモニウムが存在するため）ことは、RNAの安定化にも役立ちます。ダウンストリームアプリケーションを行う前に、RNAをこの溶液から遠心分離する必要があります。
RNaseの汚染源
RNase汚染の一般的な原因には、ラボベンチ、ピペッター、ガラス器具、チューブ、チップ、電気泳動装置も備えていますRNAを扱う場合、微量遠心機やPCRチューブ、ピペットチップなどのラボ用プラスチック消耗品がRNaseフリーであることを確認することが重要です。ベンチトップ、遠心分離機、電気泳動装置などの実験室の表面はすべて、環境汚染物質にさらされているため、RNaseで汚染されていると推定すべきです。ラボ表面のRNase汚染源には、多くの場合、細菌や真菌の胞子やヒトの皮膚から放出された死細胞（手など）が含まれます。
RNaseのいたるところに存在する性質により、分子生物学アプリケーションで使用される水とバッファーはRNase汚染の原因となることがよくあります。DEPC処理は、水およびバッファー中のRNaseを不活性化するためにもっとも一般的に使用される方法です。ただし、TRISなどの特定の試薬はDEPC処理できません。
RNA鎖の切断
RNAの分解が見られるたびにRNase汚染が最も疑われますが、RNA分子は、Mg2+やCa2+などの二価陽イオンが存在する場合に、>80℃で数分以上加熱されるとストランドの傷を受けることもあります。そのため、RNAの加熱が必要な場合は、キレート剤を使用する必要があります。
Ambionの科学者が推奨するRNase制御のためのスケジュール
Ambionの科学者は、RNase汚染制御の以下のスケジュールを推奨しています。
- 毎日
- RNaseフリーのバッファーおよび試薬を使用してください
- 微量遠心チューブやピペットチップなどのRNaseフリーの消耗品をご使用ください
- in vitro転写やRT-PCRなどの反応には、リボヌクレアーゼ阻害剤タンパク質および／または抗RNaseを使用します
- 毎週
- ラボのベンチトップ、ピペッター、およびチューブラックを徹底的に洗浄します
- 毎月
- RNaseのテスト水源
- 必要に応じて
- RNase用のベンチ調製済み試薬をテストします
- RNAを使用する前に、電気泳動装置を清掃してください
- RNaseの使用を取り入れた手順を行う際には、バリアまたはフィルターピペットチップを使用してください
高品質RNAのためのRNA保存およびRNase除去
RNAを保存し、RNase汚染からサンプルを保護する方法はさまざまです。1つは、RNA安定化ソリューションでの保存によりRNAを安定化することで、RNAの完全性を維持するのに役立ちます。第二に、RNase検出は、水質検査や試薬検査など、周期的かつ必要に応じて行う必要があります。第三に、RNAサンプルが貴重なラボでのRNaseコントロールを補助するRNase除去です。RNase除去法には、RNase阻害およびRNase汚染除去が含まれます。
注記：RNAサンプルがRNaseに不用意に曝露されるのを防ぐため、RNase処理が必要な手順には専用のスペースを確保することを強く推奨します。
RNAサンプルの完全性を安定化し、維持します
RNA安定化試薬を使用すると、RNA分子を安定化させ、RNAの完全性を維持することにより、RNAサンプルの使用を長くすることができます。
水とバッファーのRNase活性を定期的にテストしてください
RNAを扱う研究者には、継続的なRNaseモニタリングが必要です。RNase汚染を検出するための定期的なスケジュールを維持することが重要です。RNaseフリーのラボスペースを維持するための科学者が承認したスケジュールは、RNaseコントロールの確かなスタートです。
RNase阻害剤タンパク質
in vitro転写、逆転写、および翻訳などの酵素反応におけるRNaseとの戦いの従来の方法は、リボヌクレアーゼ阻害剤を使用することです。このタンパク質は、RNase A、B、およびCを含むリボヌクレアーゼAファミリーのみの阻害剤です
除染用品を使用することで、RNase汚染を防止します
上記で説明したRNase汚染物質の多くの源です。RNaseはルーチンのラボ研究においてこのような一般的な存在を示すため、ルーチンのRNase汚染除去プログラムを開発することが不可欠です。RNase除染試薬は、使いやすいスプレーボトルとタオル形で提供しています。
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