长片段克隆

TOPO XL-2完整PCR克隆试剂盒

轻松完成长片段DNA克隆

多种原因会给长片段克隆带来难题，这其中就包括传统分子生物学试剂自身的局限。Invitrogen™TOPO™XL-2完整PCR克隆试剂盒提供了克服这些限制的所有必要元素，并且能够精确，有效和简单地克隆高达13 kb的长PCR产物。通过使用拓扑异构酶活化的全新线性化pCR™-XL-2-TOPO™载体，只需在实验台上花费5分钟时间即可获得更高的克隆效率。该载体与使用Invitrogen™ Platinum™ SuperFi™ Green PCR预混液扩增得到的平末端PCR片段兼容。

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试剂盒组分
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产品优势
资源 — 产品手册与支持

试剂盒组分

完整PCR克隆试剂盒包含：

TOPO XL-2 PCR克隆试剂盒—包含pCR™-XL-2-TOPO载体
Platinum SuperFi Green PCR预混液– 包含一种校读DNA聚合酶（保真性超过Taq聚合酶>100倍），具有强大的合成能力，可获得准确的长链扩增子。同时还含有惰性密度梯度试剂，可实现琼脂糖凝胶直接上样电泳操作，使电泳和胶回收更加方便
PureLink™ 快速胶回收与PCR纯化两用试剂盒—利用规模离心柱，可在30分钟内从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段或直接进行PCR纯化
One Shot™ OmniMAX™ 2 T1^R 化学感受态大肠杆菌细胞 — 一款改进型高效化学感受态细胞，适用于各种克隆应用

图 1.pCR-XL-2-TOPO 载体 .

pCR-XL-2-TOPO载体（图1）包含：

用于阳性筛选的ccdB基因
PCR产物插入位点两侧有EcoRI位点，可方便地切取插入序列
氨苄青霉素和卡那霉素抗性基因供选择使用，用于抗生素筛选实验
T7启动子/引物结合位点，用于体外转录
T7、T3和M13正向和反向引物结合位点，用于测序

TOPO XL-2完整PCR克隆试剂盒的优势

高克隆效率，尤其适用于长片段DNA克隆

TOPO XL-2完整PCR克隆试剂盒经优化可实现高效克隆超长PCR片段，如图2,3和4所示。

The TOPO XL-2 Complete PCR Cloning Kit has superior cloning efficiency for a broad range of different sizes of targets.

图 2.TOPO XL-2完整PCR克隆试剂盒对一系列长度的目标DNA均具有出色的克隆效率。使用TOPO XL-2 克隆试剂盒克隆长度在1 kb到13 kb范围内的Lambda基因组DNA PCR片段。

The TOPO XL-2 cloning kit shows superior cloning efficiency compared to the TOPO XL kit.

图 3.TOPO XL-2克隆试剂盒的克隆效率比TOPO XL试剂盒更高。按照每一款试剂盒的推荐实验方案，克隆7 kb的对照插入片段。

图 4.对于一系列长度的DNA靶标，TOPO XL-2克隆试剂盒的克隆效率均超过In-Fusion克隆试剂盒（Clontech）。按照各试剂盒手册中所提供的实验方案克隆人类与lambda基因组中的DNA靶标。使用一个跨克隆靶标中3 kb（人）或~5 kb（lambda）区段的内部引物进行菌落PCR，测定克隆效率。In-Fusion克隆试剂盒中的高保真聚合酶无法有效扩增人体内10 kb的DNA靶标。（参见“插入序列准确性和特异性提高”部分中的图7 。）

插入序列的准确性和特异性提高

Platinum SuperFi DNA聚合酶是一款校读DNA聚合酶，将超高保真度与可靠的Platinum热启动技术结合在一起，可最大限度提高PCR扩增成功率。TOPO XL-2 PCR克隆试剂盒所含的Platinum SuperFi Green PCR预混液的保真度是Taq聚合酶的>100倍以上，是克隆、诱变，及其它需要超高序列准确度的实验应用（如扩增长链DNA片段）的理想之选。

Platinum SuperFi DNA Polymerase exhibits superior fidelity.

图5.Platinum SuperFi DNA聚合酶具有超高的保真度。图中显示不同DNA聚合酶的相对保真度值。聚合酶的保真度通过二代测序来测定。利用非PCR文库测序数据来评估实验误差的背景水平。以常规Taq聚合酶作为标准来衡量聚合酶的保真度。

Platinum SuperFi DNA Polymerase has higher specificity in amplifying larger targets than the Invitrogen Elongase Enzyme Mix.

图 6.在扩增较长目的片段时，Platinum SuperFi DNA聚合酶比Invitrogen™ Elongase™酶混合物特异性更高。按照生产商所提供的PCR循环参数标准对lambda基因组DNA中长为1 kb，3 kb，7 kb，10 kb和13 kb的DNA片段进行扩增。在TOPO XL PCR克隆试剂盒中推荐使用Elongase 酶混合物产品，而在TOPO XL-2完整PCR克隆试剂盒中推荐使用Platinum SuperFi DNA聚合酶。

Platinum SuperFi DNA Polymerase shows greater specificity for both human and lambda gDNA targets than Clontech’s high-fidelity (HiFi) polymerase.

图 7.在对人和lambda基因组DNA靶标的扩增过程中，Platinum SuperFi DNA聚合酶相比Clontech的高保真（HiFi）聚合酶表现出更高的特异性。按照各生产商的推荐实验方案进行扩增。在50 µL PCR反应中，取6.5 µL人类基因组DNA目的片段和4 µL lambda 基因组DNA目的片段上样至1%的琼脂糖凝胶中，并使用EtBr进行染色。

更高的DNA回收率

PureLink™ 快速胶回收与PCR纯化两用试剂盒，可同时进行快速胶回收和PCR纯化。分离得到的DNA可直接进行克隆实验。由于TOPO XL-2完整PCR克隆试剂盒包含了Purelink试剂盒，所需操作步骤更少，DNA总回收率显著提升——当处理较长DNA片段时具有很大的优势（图8）。

The PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit shows greater total DNA yields than the Invitrogen S.N.A.P. Gel Purification Kit, even for larger fragment sizes.

图 8.相对于Invitrogen™ S.N.A.P.™凝胶纯化试剂盒，PureLink 快速胶回收与PCR纯化两用试剂盒在总DNA得率方面显著提升，特别是对于较长的片段。使用Platinum SuperFi 2X Green预混液扩增不同长度经凝胶纯化的lambda PCR产物。使用PureLink（TOPO XL-2试剂盒中提供）和S.N.A.P.（TOPO XL试剂盒中提供）对同一起始材料进行相同的凝胶纯化操作，以比较两者的实验效果。具体纯化方案按照产品手册中的说明进行。对两者的总DNA产量进行定量和比较。相比S.N.A.P.试剂盒，PureLink试剂盒所获得的DNA得率有所增加。

转化效率更高的感受态细胞

>在所有Invitrogen™ One Shot™ 化学感受态大肠杆菌产品中，OmniMAX™ 2 T1R 感受态细胞具有最高的转化效率（> 5 x 109 转化体/µg pUC19）（图9）。由于OmniMAX 2 T1^R细胞缺少大肠杆菌的K12限制性系统(mcrA Δ(mrr hsdRMS mcrBC))，这种高度多功能的细胞还能够有效转化高度甲基化的DNA。此外，这一细胞系拥有tonA基因型，能够抵抗T1和T5噬菌体感染。这也将保护您的样本，最大限度缩短您实验室由于噬菌体污染所浪费的时间。

The chemically competent OmniMAX™ 2 T1R cells yield higher numbers of colony forming units (cfu) than TOP10 cells, following transformation of cloned DNA fragments.

图 9.在转化了克隆的DNA片段之后，化学感受态OmniMAX™ 2 T1^R 细胞比TOP10细胞生成更多的菌落形成单位（cfu）。将OmniMax 2 T1^R和TOP10克隆细菌培养于含有卡那霉素的筛选平板上，并仅向OmniMAX 2 T1^R细胞中加入1 mM IPTG。使用菌落PCR对十至十二个转化体进行分析。

小提示

将加入平板培养基中的1 mM IPTG涂布于平板中OmniMAX 2 T1^R细胞来减少空载体的背景，从而提高筛选效率。

高染色灵敏度

推荐使用Invitrogen™ SYBR™ Safe DNA凝胶染色剂进行凝胶染色。通过蓝光照射时，此染色剂具有最高的检测灵敏度，避免UV光照射所造成的损伤（图10）。尽管溴化乙锭（EtBr）也是一款灵敏的染料，不过紫外线会切割DNA并降低克隆效率。白光照射下可使用结晶紫进行染色而不对DNA造成损伤；不过，其检测灵敏度较低。