Dynabeads IP 引用文献。
染色质免疫沉淀（ChIP）检测用于识别与 DNA 结合蛋白（例如转录因子和组蛋白）相关的基因组区域（核酸序列）。在 ChIP 检测中，DNA与 结合的蛋白质暂时交联，在细胞裂解后剪切 DNA。靶蛋白与交联核苷酸序列一起进行免疫沉淀，然后纯化 DNA 并通过 PCR 检测识别，进行测序和微阵列分析，或以其他方式进行分析。
RNA 免疫沉淀使用类似于 ChIP 的方法，只是使用 RNA 结合蛋白代替 DNA 结合蛋白来进行免疫沉淀。然后，通过 RT-PCR 和 cDNA 测序识别发生免疫沉淀的 RNA序列。
Pierce 染色质免疫沉淀系统为染色质免疫沉淀（ChIP）提供了更快、更具重现性的解决方案，包括使用目标抗体进行 ChIP 所需的所有试剂。
ChIP 检测流程
染色质免疫沉淀（ChIP ）通过组蛋白修饰（表观遗传学）或转录因子监测转录调控，确定基因组与蛋白质组之间的联系：DNA 结合相互作用。ChIP 的优势在于它能够捕获特定蛋白质与 DNA 相互作用，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）来定量相互作用。
染色质免疫沉淀 (ChIP)是分析表观修饰和基因组 DNA 序列结合到特定调控蛋白的强大方法。
染色质 免疫沉淀 实验需要多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质 DNA 提取）、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA 样品纯化和 PCR。在优化实验期间，通常会使用其他技术（例如凝胶电泳）来验证特定步骤。
染色质免疫沉淀（ChIP）首先进行蛋白质-DNA 复合物的共价稳定化。许多蛋白质与 DNA 的相互作用是短暂的，并且涉及使用多种蛋白质复合物来协调生物学功能。体内交联可共价稳定蛋白质-DNA 复合物。
传统上，通过甲醛实现体内交联，但也可以与其他交联剂如 EGS 和 DSG 结合使用。甲醛交联是两个直接相互作用分子的理想选择。但是，甲醛为零长度交联剂，功能受到了限制。对于更高阶的相互作用，较长的交联剂（例如 EGS（16.1Å）或 DSG（7.7 Å ）可以捕获具有复杂四级结构的较大蛋白质复合物。
研究人员常使用组合交联剂来捕获蛋白质-DNA 相互作用复合物。这些交联剂直接渗透到细胞中，有效地将蛋白质-DNA 复合物锁定在一起，甚至可以捕获并稳定瞬态相互作用复合物以便进行分析。
裂解阶段从细胞或组织中提取并释放交联蛋白质-DNA 复合物。在这一阶段，通过去垢剂溶液去垢剂溶解细胞膜来释放细胞成分。由于蛋白质与 DNA 的相互作用主要发生在细胞核区域，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。去垢剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA 复合物，因为第一步共价交联已经稳定了复合物。
不建议对细胞进行机械裂解，因为它会导致无效细胞核裂解。Thermo Scientific Pierce 染色质制备模块等试剂可将细胞核与其他细胞成分分开，用于消除背景信号和提高灵敏度。
提取步骤会产生所有核物质，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白质-DNA 复合物。为了分析蛋白质结合序列，必须将提取的基因组 DNA 剪切成较小的可操作片段。DNA 片段化通常通过超声以机械方式实现，或者通过微球菌核酸酶（MNase）以酶消化方式实现。
理想的染色质片段范围可以从 200 到 > 1000 bp，但是 DNA 剪切是最难控制的步骤之一。超声处理可提供随机的碎片，但局限性包括可能需要专用机械设备、超声期间难以维持温度、动手时间延长以及需要大量优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有很高的重现性，并且更适合处理多个样品，但是，酶活性变化可导致变异性，并且该酶对核小体间区域具有更高的亲和力。
为了分离特定修饰组蛋白、目标转录因子或辅助因子，使用经 ChIP 验证的抗体来进行免疫沉淀靶标蛋白，并将靶标蛋白与其他核成分分离。该步骤选择性地富集了目标蛋白-DNA 复合物，并消除了所有其他不相关的细胞物质。
选择合适的抗体是成功进行 ChIP 的关键之一。对于哺乳动物样品，可以使用许多经过验证的 ChIP 级抗体。对于无法获得合格抗体的靶蛋白，融合蛋白（例如 带HA、myc 或 GST标签）可在生物样品中表达，然后使用针对标签的抗体对靶标蛋白进行免疫沉淀。
使用抗体结合树脂（例如固定的蛋白 A，蛋白 G 或蛋白 A/G）来亲和纯化抗体-蛋白-DNA 复合物。对于生物素化抗体，也可以使用固定的链霉亲和素或固定的 Thermo Scientific NeutrAvidin(中型亲和素)。为了降低背景，必须结合核酸和蛋白质封闭缓冲液（例如鲑鱼精子 DNA 和一般蛋白质源）来封闭抗体结合树脂。每个 ChIP 样品中使用的树脂量也会影响背景，因为填料量的增加可增加非特异性结合。
富集与目标蛋白质结合的 DNA 是染色质免疫沉淀的目标。DNA 状况可以通过琼脂糖凝胶电泳确定，或通过更常见的定量聚合酶链反应（qPCR）确定。在扩增和测量染色质免疫沉淀的特异 DNA 序列之前，必须解开蛋白质和 DNA 之间的交联。通常通过大量温育或蛋白酶 K 消化蛋白质成分完成。
蛋白酶 K 在脂肪族、芳香族或疏水性残基的羧基侧剪切。由于蛋白酶 K 具有广泛的特异性，通常用于去除 DNA 或 RNA 样品中的蛋白质。此外，蛋白酶 K 消化可消除纯化 DNA 中的核酸酶，从而防止降解。为了从蛋白质片段中分离 DNA，可结合使用苯酚-氯仿与标准 DNA 纯化方法。或者，可以使用设计用于从复杂生物样品中纯化核酸材料的离心柱。
ChIP 的特点是能够通过qPCR 来为纯化的 DNA 产物进行定量。除了作为扩增工具，qPCR还可在不同的实验条件下准确测量靶蛋白-DNA 的水平。免疫沉淀复合物与结合 DNA 之间存在数量上的直接相关性。
Pierce 染色质免疫沉淀系统为染色质免疫沉淀（ChIP）提供了更快、更具重现性的解决方案，包括使用目标抗体进行 ChIP 所需的所有试剂。
ChIP 检测流程
染色质免疫沉淀（ChIP ）通过组蛋白修饰（表观遗传学）或转录因子监测转录调控，确定基因组与蛋白质组之间的联系：DNA 结合相互作用。ChIP 的优势在于它能够捕获特定蛋白质与 DNA 相互作用，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）来定量相互作用。
染色质免疫沉淀 (ChIP)是分析表观修饰和基因组 DNA 序列结合到特定调控蛋白的强大方法。
染色质 免疫沉淀 实验需要多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质 DNA 提取）、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA 样品纯化和 PCR。在优化实验期间，通常会使用其他技术（例如凝胶电泳）来验证特定步骤。
染色质免疫沉淀（ChIP）首先进行蛋白质-DNA 复合物的共价稳定化。许多蛋白质与 DNA 的相互作用是短暂的，并且涉及使用多种蛋白质复合物来协调生物学功能。体内交联可共价稳定蛋白质-DNA 复合物。
传统上，通过甲醛实现体内交联，但也可以与其他交联剂如 EGS 和 DSG 结合使用。甲醛交联是两个直接相互作用分子的理想选择。但是，甲醛为零长度交联剂，功能受到了限制。对于更高阶的相互作用，较长的交联剂（例如 EGS（16.1Å）或 DSG（7.7 Å ）可以捕获具有复杂四级结构的较大蛋白质复合物。
研究人员常使用组合交联剂来捕获蛋白质-DNA 相互作用复合物。这些交联剂直接渗透到细胞中，有效地将蛋白质-DNA 复合物锁定在一起，甚至可以捕获并稳定瞬态相互作用复合物以便进行分析。
裂解阶段从细胞或组织中提取并释放交联蛋白质-DNA 复合物。在这一阶段，通过去垢剂溶液去垢剂溶解细胞膜来释放细胞成分。由于蛋白质与 DNA 的相互作用主要发生在细胞核区域，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。去垢剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA 复合物，因为第一步共价交联已经稳定了复合物。
不建议对细胞进行机械裂解，因为它会导致无效细胞核裂解。Thermo Scientific Pierce 染色质制备模块等试剂可将细胞核与其他细胞成分分开，用于消除背景信号和提高灵敏度。
提取步骤会产生所有核物质，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白质-DNA 复合物。为了分析蛋白质结合序列，必须将提取的基因组 DNA 剪切成较小的可操作片段。DNA 片段化通常通过超声以机械方式实现，或者通过微球菌核酸酶（MNase）以酶消化方式实现。
理想的染色质片段范围可以从 200 到 > 1000 bp，但是 DNA 剪切是最难控制的步骤之一。超声处理可提供随机的碎片，但局限性包括可能需要专用机械设备、超声期间难以维持温度、动手时间延长以及需要大量优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有很高的重现性，并且更适合处理多个样品，但是，酶活性变化可导致变异性，并且该酶对核小体间区域具有更高的亲和力。
为了分离特定修饰组蛋白、目标转录因子或辅助因子，使用经 ChIP 验证的抗体来进行免疫沉淀靶标蛋白，并将靶标蛋白与其他核成分分离。该步骤选择性地富集了目标蛋白-DNA 复合物，并消除了所有其他不相关的细胞物质。
选择合适的抗体是成功进行 ChIP 的关键之一。对于哺乳动物样品，可以使用许多经过验证的 ChIP 级抗体。对于无法获得合格抗体的靶蛋白，融合蛋白（例如 带HA、myc 或 GST标签）可在生物样品中表达，然后使用针对标签的抗体对靶标蛋白进行免疫沉淀。
使用抗体结合树脂（例如固定的蛋白 A，蛋白 G 或蛋白 A/G）来亲和纯化抗体-蛋白-DNA 复合物。对于生物素化抗体，也可以使用固定的链霉亲和素或固定的 Thermo Scientific NeutrAvidin(中型亲和素)。为了降低背景，必须结合核酸和蛋白质封闭缓冲液（例如鲑鱼精子 DNA 和一般蛋白质源）来封闭抗体结合树脂。每个 ChIP 样品中使用的树脂量也会影响背景，因为填料量的增加可增加非特异性结合。
富集与目标蛋白质结合的 DNA 是染色质免疫沉淀的目标。DNA 状况可以通过琼脂糖凝胶电泳确定，或通过更常见的定量聚合酶链反应（qPCR）确定。在扩增和测量染色质免疫沉淀的特异 DNA 序列之前，必须解开蛋白质和 DNA 之间的交联。通常通过大量温育或蛋白酶 K 消化蛋白质成分完成。
蛋白酶 K 在脂肪族、芳香族或疏水性残基的羧基侧剪切。由于蛋白酶 K 具有广泛的特异性，通常用于去除 DNA 或 RNA 样品中的蛋白质。此外，蛋白酶 K 消化可消除纯化 DNA 中的核酸酶，从而防止降解。为了从蛋白质片段中分离 DNA，可结合使用苯酚-氯仿与标准 DNA 纯化方法。或者，可以使用设计用于从复杂生物样品中纯化核酸材料的离心柱。
ChIP 的特点是能够通过qPCR 来为纯化的 DNA 产物进行定量。除了作为扩增工具，qPCR还可在不同的实验条件下准确测量靶蛋白-DNA 的水平。免疫沉淀复合物与结合 DNA 之间存在数量上的直接相关性。
IP 和 ChIP 文章发布趋势
免疫沉淀的发表趋势说明了一切。Dynabeads 磁珠与免疫沉淀操作其他技术和产品的引用量正在急剧增长。
Dynabeads ChIP 参考文献。
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。