我们的交联免疫沉淀（CLIP）实验方法将紫外光交联和 Dynabeads 免疫沉淀相结合。下游工作流程包括绘制 RNA 蛋白结合位点，以进一步了解转录后调控网络。

在免疫沉淀（IP）程序中，抗体重链和轻链抗体片段与靶抗原的共洗脱可能会对下游分析造成干扰。消除这种抗体干扰的一种方法是在进行 IP 实验前将固定的抗体共价交联到 IP 磁珠上。由于抗体与磁珠化学结合，因此在使用非变性、非还原性洗脱缓冲液洗脱抗原后，抗体仍附着在磁珠上。

以下实验方法说明了5 µg IgG 与50 µL Dynabeads 蛋白 A、Dynabeads 蛋白 G、免疫沉淀试剂盒蛋白 A 或免疫沉淀试剂盒蛋白 G 的交联。程序使用 Pierce BS3 交联剂 （货号21580），其是一种水溶性交联剂，在生理 pH 调件下在伯胺之间产生不可逆（稳定的酰胺）键。该免疫沉淀交联实验方法可根据需要扩大或缩小。

1. 制备100 mM BS³  结合缓冲液（储备液）。用结合缓冲液稀释以制备5 mM 溶液，每份样品需要250 μL。
   备注：BS³  储备液和结合溶液必须在使用前新鲜配制。
2. 在200 μL 结合缓冲液中将 Ig 偶联 Dynabeads 蛋白 A 或蛋白 G 洗涤两次。置于磁铁上并弃去上清液。
3. 将 Dynabeads 重悬于250 μL 5 mM BS³ 中。
4. 在室温下孵育 30 分钟，同时进行倾斜/旋转。
5. 加入12.5 μL 淬灭缓冲液，淬灭交联反应
6. 在室温下孵育 15 分钟，同时进行倾斜/旋转。
7. 用200 μL PBST（或所选 IP 缓冲液）将交联的 Dynabeads 洗涤三次。置于磁铁上并弃去上清液。
8. 继续进行 IP 和抗原洗脱（从免疫沉淀实验方法的步骤 2.3 开始）。

如果可能，BS³ 实验方法应为首选/推荐实验方法。

BS³  结合缓冲液： 20 mM 磷酸钠，0.15 M NaCl（pH 7-9）
BS³ 淬灭缓冲液： 1 M Tris HCl（pH 7.5）

1. 在 DMSO 或 DMF（贮备液）中制备10-25 mM DSS。用结合缓冲液稀释以制备5 mM 溶液，每份样品需要250 μL。
   备注：DSS 储备液和结合溶液必须在使用前新鲜配制！ 
   
2. 将 Ig 偶联的 Dynabeads 蛋白 A 或蛋白 G 在200 µL 偶联缓冲液中洗涤三次。置于磁铁上并弃去上清液。
3. 将 Dynabeads 重悬于250 μL 1-5 mM DSS 中。
4. 在室温下孵育 30 分钟，同时进行倾斜/旋转。
5. 加入12.5 μL 淬灭缓冲液，淬灭交联反应
6. 在室温下孵育15 分钟，同时进行倾斜/旋转。
7. 用200 μL PBST（或所选 IP 缓冲液）将交联的 Dynabeads 洗涤三次。置于磁铁上并弃去上清液。
8. 继续进行 IP 和抗原洗脱（从免疫沉淀实验方法的步骤 2.3 开始）。

交联溶液：临用前，将 DSS 溶于10-25 mM 干燥 DMSO 中。DSS 不溶于水
结合缓冲液：磷酸盐缓冲盐水（PBS）：20 mM 磷酸钠，0.15 M NaCl；pH 8。pH 7-9 之间的 HEPES、碳酸氢盐/碳酸盐或硼酸盐缓冲液可用作替代缓冲液。 
淬灭缓冲液：1 M Tris HCl（pH 7.5）（也可以使用1 M 甘氨酸或赖氨酸）

备注：DSS 交联剂对水分敏感。打开小瓶前，使其复温至室温，以防止形成冷凝。 储存时使用合适的干燥剂。临用前将 DSS 溶于 DMSO 或 DMF 中。 

DSS 与含胺缓冲液不兼容，在结合步骤中应避免使用（如 Tris、甘氨酸）。