GeneSwitch™ 系统概述

GeneSwitch™ 系统是米非司酮诱导型哺乳动物表达系统，最初由 Wang 等人(1994) 开发，该系统结合了来自各种人和酵母转录因子的调节组分。GeneSwitch™ 系统中的米非司酮调节基于自动调节反馈回路，此回路涉及 GAL4 调节融合蛋白（见下文）与控制 GAL4 调节融合蛋白表达的启动子以及控制目标基因表达的启动子中的 GAL4 上游激活序列 (UAS) 结合。GeneSwitch™ 系统的主要组分包括：

• 诱导型表达质粒 pGene/V5-His，在含有 GAL4 上游激活序列 (UAS) 和腺病毒 E1b TATA 盒的杂交启动子控制下表达您的目标基因
• 调节质粒 pSwitch，编码含有酵母 GAL4 DNA 结合域 (DBD)、截短人孕激素受体配体结合域 (hPR-LBD) 和源自人 NF-kB 的 p65 激活域 (AD) 的融合蛋白
• 含 lacZ 基因的对照表达质粒 pGene/V5-His/lacZ，当与 pSwitch 共转染时，在米非司酮诱导下可表达 β-半乳糖苷酶
• 米非司酮，用于诱导表达

GeneSwitch™ 系统的描述

GeneSwitch™ 系统利用了转录因子由功能域（如 DNA 结合域 [DBD] 或激活域 [AD]）组成这一事实。GeneSwitch™ 系统所表达的杂交调节蛋白包含来自酵母 GAL4 蛋白的 DBD、来自人孕激素受体的截短配体结合域 (LBD) 和来自人 NF-kB 蛋白的 AD。这种杂交调节蛋白与合成类固醇米非司酮结合，作为配体依赖型转录因子发挥作用，用于诱导目标基因表达及其自身表达。

GeneSwitch™ 系统的第一种主要组分是 pGene/V5-His 诱导型表达质粒。诱导型表达质粒表达目标基因的过程由一种杂交启动子控制，该杂交启动子包含与源自腺病毒主要晚期 E1b 基因的 TATA 盒序列（Lillie 和 Green，1989）相连的酿酒酵母 GAL4 上游激活序列 (UAS)（Giniger 等人，1985；Wang 等人，1994）。GAL4 UAS 中包含6个拷贝的17核苷酸序列 (5' -(T/C)GGAGTACTGTCCTCCG-3')，这构成酵母 GAL4 转录因子的结合位点。每个17核苷酸序列用作2个 GAL4 DBD 分子的结合位点（Marmorstein 等人，1992）。

GeneSwitch™ 系统的第二种主要组分是 pSwitch 调节载体，其在一种杂交启动子的控制下表达 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节融合蛋白，该杂交启动子包含与源自单纯疱疹病毒胸苷激酶 (TK) 基因的最小启动子相连接的 GAL4 UAS（包含4个拷贝的 GAL4 结合位点）。

自动调节和诱导机制

通过共转染，将 pSwitch 调节载体和 pGene/V5-His 构建体引入所选哺乳动物细胞系中。在没有米非司酮的情况下，来自 pSwitch 的 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 融合基因在最小胸苷激酶 (TK) 启动子的控制下发生低基础转录。翻译成蛋白质后，GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节蛋白（GeneSwitch™ 蛋白）主要以无活性形式位于细胞核中。 添加米非司酮后，米非司酮与 GeneSwitch™ 蛋白中的截短 hPR-LBD 以高亲和力 (Kd ~ 3 x 10-9 M) 结合（Vegeto 等人，1992），并引起 hPR-LBD 构象变化，导致 GeneSwitch™ 蛋白二聚化并转换为活性形式。随后，配体结合的 GeneSwitch™ 同源二聚体与 pGene/V5-His 和 pSwitch 的 GAL4 UAS 中的 GAL4 结合位点相互作用，并激活受 E1b TATA 盒控制的目标基因转录和受最小 TK 启动子控制的调节融合基因转录。通过启动自动调节反馈回路进一步扩大目标基因表达，配体结合的 GeneSwitch™ 蛋白通过此回路上调自身基因的表达。新合成的 GeneSwitch™ 蛋白与米非司酮结合，经构象变化转换为活性状态，并诱导目标基因及其自身基因转录。.有关孕激素受体及其作用机制和配体-受体相互作用的更多信息，请参阅已发表的综述和文章（DeFranco，1998；Gasc 等人，1989；Guiochon-Mantel 等人，1989；Simons，1998；Ylikomi 等人，1992）。

网站

GeneSwitch™ 系统是对 Wang 等人 (1994) 最初描述的基因开关调节系统进行改良的版本。有关基因开关技术的其他信息和出版物，请参阅 Valentis, Inc. 管理的网站。

有关 GeneSwitch™ 系统的具体信息，请下载用户手册 或致电技术服务部门。

GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节蛋白

pSwitch 质粒表达的 GAL4-DBD/hPR-LBD/p650-AD 调节融合蛋白（GeneSwitch™ 蛋白）是 73 kDa 杂交蛋白，由源自以下三种转录因子的指定调节域组成。

• 在 GeneSwitch™ 系统中，GeneSwitch™ 蛋白作为配体依赖型转录因子，通过与 GAL4 UAS 内的 GAL4 位点结合而同时激活目标基因及其自身基因的表达。来自上述转录因子的功能域组合使得 GeneSwitch™ 蛋白具有以下特性。由于 GAL4 DBD 来自酵母蛋白，因此 GeneSwitch™ 蛋白对内源基因无影响，只能激活表达情况受 GAL4 UAS 控制的基因（即目标基因和调节融合基因）的转录。

• GAL4 DBD 以同源二聚体的形式与单个17核苷酸 GAL4 结合位点结合（Carey 等人，1989；Marmorstein 等人，1992）。pGene/V5-His 和 pSwitch 质粒分别包含6个拷贝和4个拷贝的 GAL4 结合位点，但尚不清楚是否在任何给定时间时所有 GAL4 结合位点均被占用。 截短 hPR-LBD 的 C 端缺失19个氨基酸，从而不能与孕激素、其他内源性类固醇激素或其他孕激素激动剂结合，但仍然能够与米非司酮以高亲和力结合（Vegeto 等人，1992；Wang 等人，1994；Wang 等人，1997）。

• p65 AD 是一种强转录激活因子，但来自人源蛋白，从而最大限度减少与病毒反式激活域相关的可能毒性或多效性作用（Abruzzese 等人，1999；Burcin 等人，1999）

米非司酮诱导标志

合成类固醇米非司酮在 GeneSwitch™ 系统中用作诱导剂。该系统中的米非司酮诱导标志如下所列：

• 诱导基因表达需要极低浓度的米非司酮（即 1 x 10-8 M 米非司酮）
• 在GeneSwitch™ 系统中，半数最大诱导所需的米非司酮浓度约为 10-10 M
• 用于基因诱导的米非司酮浓度不会对缺乏内源性孕激素和糖皮质激素受体的哺乳动物细胞产生已知毒性或多效性作用（Vegeto 等人，1992；Wang 等人，1994）  

实验概述

为使用 GeneSwitch™ 系统表达您的目标基因，您将执行以下步骤：（参见下图）：

1. 将您的目标基因与 pGene/V5-His 诱导型表达载体的多克隆位点结合。


2. 将您的 pGene/V5-His 构建体和 pSwitch 调节质粒共转染到所选哺乳动物细胞系中。


3. 添加米非司酮，通过涉及 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节融合蛋白的自动调节反馈回路，诱导目标基因表达。


4. 检测目标重组蛋白的表达情况。

备注：  可将含有 lacZ 基因的阳性对照载体 (pGene/V5-His/lacZ) 与 pSwitch 瞬时共转染到哺乳动物细胞中，以证明该系统能在您的细胞系中正常工作。可建立通过 pSwitch 表达 GAL4 DBD/hPR-LBD/p65 AD 调节融合蛋白的稳定细胞系，用作基于诱导型表达载体的构建体的宿主。

GeneSwitch™ 系统手册随下列试剂盒一起提供。核心系统包括载体、测序引物和诱导剂米非司酮。完整系统包括核心系统和筛选剂。每个 GeneSwitch™ 系统的组分详述见下文。

试剂盒组分
   
GeneSwitch™ 完整系统和 GeneSwitch™ 核心系统均包括以下调节载体、测序引物和诱导剂。将所有试剂储存于 -20°C 下。

表达载体

各 GeneSwitch™ 完整系统和核心系统还包括用于克隆您的目标基因的诱导型表达载体以及包含 lacZ 基因的相应阳性对照载体，如下所述。诱导型表达载体以三种阅读框形式提供，以便在所含 C 端肽具有 V5 表位和多聚组氨酸标签的框内克隆目标基因。

载体                                                       含量
pGene/V5-His A、B、C         各 20 µg，TE 冻干，pH 值8.0
pGene/V5-His/lacZ             20 µg，TE 冻干，pH 值8.0

筛选剂
         
除 GeneSwitch™ 核心系统中提供的载体和引物外，GeneSwitch™ 完整系统还包括下列筛选剂。Zeocin™ 以 8 x 1.25 mL 等分试样形式提供，浓度为 100 mg/mL。

介绍

本部分包含 GeneSwitch™ 载体增殖指南。
 
大肠杆菌菌株
     
许多大肠杆菌菌株适用于增殖 GeneSwitch™ 载体，包括 TOP10（货号 C610-00）和 DH5a。我们建议在重组缺陷 (recA) 和核酸内切酶 A 缺陷 (endA) 型大肠杆菌菌株中增殖 GeneSwitch™ 载体。为方便您使用，我们以化学感受态细胞或电转感受态细胞形式提供 TOP10 和 DH5a 大肠杆菌。

转化方法

您可以使用任一可选方法进行转化。化学转化最方便，但电穿孔最有效且是转化大质粒的首选方法。
 
质粒维持

GeneSwitch™ 载体包含氨苄青霉素抗性基因，因此可使用氨苄青霉素筛选质粒。pGene/V5-His A、B、C 和 pGene/V5-His/lacZ 载体同样含有 Zeocin™ 抗性基因，因此可使用 Zeocin™ 筛选质粒。为增殖和维持 GeneSwitch™ 质粒，请遵循以下程序：

  1.   将各载体重悬于 20 µL 无菌水中，以制备 1 µg/µL 储备液。将储备液储存在 -20℃ 下。
 
  2.   使用储备液转化 recA、endA 大肠杆菌菌株，如 TOP10、DH5a 或等同菌株。
 
  3.   如下所示，在相应的培养板上筛选转化体：

• 对于 pGene/V5-His A、B、C 和 pGene/V5-His/lacZ 质粒，在含有 50-100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上或含有 25-50 µg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 平板上筛选
  
• 对于 pSwitch 质粒，在含有 50-100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上筛选

备注：  为快速、简便微波制备含氨苄青霉素或 Zeocin™ 的低盐 LB 琼脂，imMedia™ Amp 琼脂（货号 Q601-20）或 imMedia™ Zeo 琼脂（货号 Q621-20）可供使用。有关更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。


  4.   制备含质粒的各转化体的甘油储备液，以供长期储存。

介绍

您将通过 pGene/V5-His 诱导型表达载体表达您的目标基因。pGene/V5-His 载体以包含多克隆位点的三种阅读框（A、B 和 C）形式提供，以便在所含 C 端肽具有 V5 表位和多聚组氨酸 (6xHis) 标签的框内克隆目标基因。使用提供的示意图，帮助您设计在含 C 端肽的框内克隆目标基因的策略。本部分将讨论克隆和转化的一般考虑因素。

一般分子生物学技术

如需有关大肠杆菌转化、限制性内切酶分析、DNA 生物化学和质粒制备方面的帮助，请参阅《分子克隆：实验室手册》（Sambrook 等人，1989）或《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。
 
克隆考虑因素

您的插入片段应包含带有 ATG 起始密码子的 Kozak 翻译起始序列，以确保正确启动翻译（Kozak，1987；Kozak，1991；Kozak，1990）。下文提供了 Kozak 共有序列的示例。请注意，可能存在其他序列，但 –3 位置的 G 或 A 以及 +4 位置的 G 对于发挥功能最为关键（以粗体显示）。ATG 起始密码子带有下划线。
(G/A)NNATGG
 
为将您的基因表达为重组融合蛋白，您必须在包含 C 端肽的框内克隆基因。载体以三种阅读框形式提供，以便于克隆。如果您希望在没有 C 端肽的情况下表达您的蛋白质，请确保包含终止密码子。
 
A 版的多克隆位点

以下是 pGene/V5-His A 的多克隆位点，标记了限制性酶切位点以指示切割位点。加框的核苷酸表示可变区。请注意，多位点接头中 Spe I 和 BstX I 位点之间存在一个终止密码子。另外，请注意，GAL4 结合位点的序列不相同。通过测序和功能检测确认了多克隆位点。如需 pGene/V5-His A 的完整序列，可在此下载或联系技术服务部门。






*请注意，多位点接头中有两个 BstX I 位点。

B 版的多克隆位点

以下是 pGene/V5-His B 的多克隆位点，标记了限制性酶切位点以指示切割位点。加框的核苷酸表示可变区。请注意，GAL4 结合位点的序列不相同。通过测序和功能检测确认了多克隆位点。如需 pGene/V5-His B 的完整序列，可在此下载或联系技术服务部门。





*请注意，多位点接头中有两个 BstX I 位点


C 版的多克隆位点

以下是 pGene/V5-His C 的多克隆位点，标记了限制性酶切位点以指示切割位点。加框的核苷酸表示可变区。请注意，GAL4 结合位点的序列不相同。通过测序和功能检测确认了多克隆位点。如需 pGene/V5-His C 的完整序列，可在此下载或联系技术服务部门。







*请注意，多位点接头中有两个 BstX I 位点。

大肠杆菌转化

将您的连接混合物转化至感受态 recA、endA 大肠杆菌菌株（如 TOP10、DH5a）中，然后在含有 50-100 mg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板或含有 25-50 mg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 琼脂平板上筛选。筛选出 10-20 个克隆，分析是否存在插入片段及其方向。
 
所有包含完整 Tn5 转座子的大肠杆菌菌株（即 DH5aF' IQ、SURE、SURE2）均编码 ble（博来霉素）抗性基因。这些菌株会对 Zeocin™ 产生抗性。为采用 Zeocin™ 进行最高效的筛选，我们建议您选择不含 Tn5 基因的大肠杆菌菌株（即 TOP10、TOP10F'）。
 
大肠杆菌的 Zeocin™ 筛选

为便于筛选抗 Zeocin™ 的大肠杆菌，培养基的盐浓度必须保持在较低水平 (< 90 mM)，pH 值必须为7.5。制备低盐 LB 肉汤和平板。
 
若未降低 LB 培养基的盐含量，则会导致因 Zeocin™ 失活而无法筛选。
 
我们建议您使用随试剂盒提供的 pGene 正向引物和 BGH 反向引物对构建体进行测序，以确认您的基因含有 ATG 起始密码子并且在包含 C 端肽的框内克隆（如有需要）。引发位点的序列和位置见相应的示意图。
 
制备甘油储备液

鉴别出正确克隆后，请确保纯化菌落并制备甘油储备液，以供长期储存。另一项适当选择是，将您的质粒 DNA 储备液储存在 –20℃ 下。

1. 在含有 50 mg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上或含有 25-50 mg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 平板上划线接种原始菌落。在 37℃ 下过夜孵育平板。


2. 分离单个菌落，接种至 1-2 mL 含有 50 mg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基或含有 25-50 mg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 培养基中。


3. 让培养物生长至中对数阶段 (OD600 = 0.5-0.7)。


4. 取 0.85 mL 培养物与 0.15 mL 无菌甘油混合，然后转移至冻存管中。


5. 在 -80℃ 下储存。 

介绍

您将目标基因克隆到 pGene/V5-His 中并制备 pGene/V5-His 构建体和 pSwitch 的纯净质粒制剂后，即可将质粒共转染到所选哺乳动物细胞系中。我们建议您纳入阳性对照载体（见下文）和转染试剂对照以评价结果。下一页提供了共转染和诱导的一般指南。

质粒制备

用于转染真核细胞的质粒 DNA 必须非常纯净，不含苯酚和氯化钠。污染物会杀死细胞，而盐会干扰脂质，从而降低转染效率。我们建议使用 S.N.A.P.™ 小提试剂盒（10-15 mg DNA，货号 K1900-01）、S.N.A.P.™ 中提试剂盒（10-200 mg DNA，货号 K1910-01）或 CsCl 梯度离心分离质粒 DNA。
 
转染方法

对于已建立的细胞系（如 HeLa、COS-1），请查阅原始参考文献或咨询您的细胞系供应商，以了解最佳转染方法。我们建议您严格遵循针对您的细胞系所制定的方案。应特别注意培养基要求，何时进行细胞传代，以及分流细胞所用的稀释比例。更多信息见《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。

转染方法包括磷酸钙法（Chen 和 Okayama，1987；Wigler 等人，1977）、脂质体介导法（Felgner 等人，1989；Felgner 和 Ringold，1989）和电穿孔转染法（Chu 等人，1987；Shigekawa 和 Dower，1988）。我们提供磷酸钙转染试剂盒和阳离子脂质体试剂（包括 Lipofectamine™ 2000）用于转染。有关可用转染试剂的更多信息，请访问我们的网站 或致电技术服务部门。

阳性对照

提供的 pGene/V5-His/lacZ 为哺乳动物细胞转染和表达的阳性对照载体，可用于优化您的细胞系的诱导条件。阳性对照载体与 pSwitch 共转染导致在添加米非司酮后诱导 β-半乳糖苷酶表达。成功共转染后会发生 β-半乳糖苷酶表达，这可被轻松检测到（见下文）。

β-半乳糖苷酶活性测定

通过使用不含细胞的裂解物进行活性测定（Miller，1972）或采用细胞染色法进行活性测定，您可测定β-半乳糖苷酶的表达。我们提供 β-半乳糖苷酶检测试剂盒（货号 K1455-01）以及 β-半乳糖苷酶染色试剂盒（货号 K1465-01），用以快速、轻松地检测 β-半乳糖苷酶表达。

米非司酮

在 GeneSwitch™ 系统中，合成类固醇米非司酮用作诱导剂，以激活目标基因转录以及 GeneSwitch™ 调节蛋白转录。虽然米非司酮通常表现为孕激素拮抗剂（Philibert 等人，1985），但该化合物在 GeneSwitch™ 系统中实际上是激动剂，通过结合 GeneSwitch™ 蛋白中的截短 hPR-LBD 发挥作用（Vegeto 等人，1992；Wang 等人，1994；Wang 等人，1997）。与米非司酮结合后，hPR-LBD 发生构象变化，使得 GeneSwitch™ 蛋白从无活性形式转换为活性形式。然后，活性调节蛋白作为配体依赖型转录因子发挥作用，激活目标基因及其自身基因表达。只需极低剂量的米非司酮（纳摩尔范围）即可激活基因转录。

备注：  米非司酮可结合包含天然受体的细胞系中的孕激素和糖皮质激素受体。在这些细胞系（如一些中国仓鼠卵巢 [CHO] 细胞系和 HeLa 细胞系）中，米非司酮可能对天然受体产生拮抗作用。但是，在 GeneSwitch™ 系统中，用于诱导基因表达的米非司酮浓度不会对缺乏内源性孕激素和糖皮质激素受体的哺乳动物细胞产生已知毒性或多效性作用。
 
米非司酮有毒。请勿摄入或吸入粉末或含有此药的溶液。处理大量米非司酮时务必小心。高剂量 (> 100 mg) 米非司酮可能会损害生育力，并可能对胎儿造成伤害。处理米非司酮和含米非司酮的溶液时，请始终佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。
 
我们发现，通过改变瞬时共转染到哺乳动物细胞中的 pSwitch 和 pGene/V5-His 质粒的比例，可以使基础转录最小化并优化米非司酮对来自 pGene/V5-His 表达质粒的目标基因的调节。

通常，我们建议您以至少 1:4 (w/w) 的 pSwitch:pGene/V5-His 质粒 DNA 比例共转染哺乳动物宿主细胞系。请注意，结果可能因细胞系和目标基因而异；因此，您可能需要根据经验确定用于共转染特定细胞系的 pSwitch:pGene/V5-His 最佳比例。

尽管 GeneSwitch™ 系统专为多种哺乳动物细胞系而设计，但可能有一些宿主细胞系因可检测到基础转录或目标基因诱导性低而不适用。我们观察到，在中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞中可检测到基础表达且源自 pGene/V5-His/lacZ（与 pSwitch 共转染后）的 lacZ 基因诱导性低；因此，我们不推荐使用 GeneSwitch™ 系统对 CHO 细胞进行瞬时转染实验。
 
共转染和米非司酮诱导

下文介绍了将 pGene/V5-His 构建体（或对照质粒）与 pSwitch 共转染到您选择的哺乳动物细胞系中并使用米非司酮诱导目标蛋白表达的一般指南。由于各细胞系存在差异并可能需要不同的转染方法，因此可能需要通过开展一些经验性实验以确定诱导表达的最佳条件。一般而言：

• 使用达到约 60% 汇合度的细胞进行转染。
• 使用您的首选方法，将 pSwitch 质粒和 pGene/V5-His 构建体按照至少 1:4 (w:w) 的比例或您确定的最佳比例共转染到所选细胞系中。质粒的绝对量具体取决于转染方法和使用的细胞系。
• 转染后，加入新鲜培养基，待细胞恢复24小时后进行诱导。
• 移除培养基，向细胞中添加含有适当浓度米非司酮的新鲜培养基。通常，我们建议您向细胞中加入米非司酮至终浓度为 1 x 10-8 M（每 10 mL 培养基中加入 10 mL 的 10 mM 储备液），并将细胞置于 37℃ 下孵育24小时。

检测重组融合蛋白

如果您已在包含 C 端肽的框内克隆您的基因，则可以使用我们的抗 V5 抗体或抗 His（C 端）抗体检测源自 pGene/V5-His 的重组融合蛋白表达（订购信息见第 vii 页）。此外，可使用 Positope™ 对照蛋白质（货号 R900-50）作为阳性对照，用于检测含有 V5 表位和多聚组氨酸 (6xHis) 标签的融合蛋白。有关更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。为通过蛋白质印迹法检测融合蛋白，您需要使用转染后的细胞制备细胞裂解液。我们建议您设定一个时间段来优化融合蛋白的表达（如，米非司酮诱导后12、24、36、48小时等）。为检测 pGene/V5-His/lacZ 对照质粒的 β-半乳糖苷酶表达，我们通常在米非司酮诱导24小时后收获细胞。使用以下方案裂解细胞。也可以使用适宜的其他方案。

1. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS，货号 10010-023）洗涤单层细胞（约 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞）一次。


2. 将细胞刮入 1 mL PBS 中，在 1500 x g 下离心5分钟以沉淀细胞。


3. 重悬于 50 mL 细胞裂解缓冲液中。也可以使用其他适合的细胞裂解缓冲液。涡旋。


4. 在 37℃ 下孵育细胞悬液10分钟以裂解细胞。备注：如果蛋白质可能发生降解，您可以选择在室温或冰上裂解细胞。


5. 在 +4℃ 下以 10,000 x g 离心细胞裂解液10分钟，使细胞核沉淀并将上清液转移到新试管中。测定裂解液中的蛋白质浓度。

备注：   


6. 添加 SDS-PAGE 上样缓冲液至终浓度为 1X，将样本煮沸5分钟。


7. 将 20 mg 裂解物上样至 SDS-PAGE 凝胶上，开始电泳。使用适当比例的丙烯酰胺来分离融合蛋白。

 
含有 V5 表位和多聚组氨酸 (6xHis) 标签的 C 端肽将使您的蛋白大小增加约 5 kDa。
 
纯化您的重组蛋白

您需要约 5 x 10⁶ 至 1 x 10⁷ 个转染的细胞用于在 2 mL ProBond™ 或 Ni-NTA 纯化柱中纯化蛋白质。请参考第21页上的步骤，制备细胞以供裂解。

优化表达

您可能需要改变米非司酮的浓度（1 x 10-7 M 至 1 x 10-10 M）和暴露于米非司酮的时间（12-72 小时），以优化或调节细胞系的表达。
 

介绍

确定您的构建体能够发生诱导性表达后，您可构建一个诱导表达目标基因的稳定细胞系。pGene/V5-His 和 pSwitch 载体分别含有 Zeocin™ 抗性基因和潮霉素抗性基因，因此能够使用筛选剂 Zeocin™ 和潮霉素 B 筛选稳定的细胞系。我们建议您首先生成一个只表达 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节融合蛋白的稳定细胞系，然后使用该细胞系创建另一通过诱导型表达质粒表达目标基因的细胞系。（参见下文的备注）。或者，您可以共转染两种质粒（pSwitch 和 pGene/V5-His）并使用潮霉素 B 和 Zeocin™ 进行双重筛选，以分离同时表达调节融合蛋白和目标基因的单个稳定细胞系。

以下部分提供了通过转染生成稳定细胞系的指南和说明。
如果您在转染 pSwitch 质粒前将 pGene/V5-His 构建体转染到哺乳动物宿主细胞中，则您的目标基因应该不会发生表达。哺乳动物细胞不含内源性 GAL4 蛋白；因此，除非存在 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节融合蛋白，否则应该不会诱导目标基因转录。尽管 E1b TATA 序列可能并不完全静默，但 pGene/V5-His 质粒的基础转录通常不可检出。
 
提醒：当生成通过 pSwitch 表达 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节融合蛋白的稳定细胞系时，请筛选在无米非司酮的情况下 GeneSwitch™ 蛋白表达水平的克隆以及在使用米非司酮诱导后表达水平最高的克隆。您可以通过使用 pGene/V5-His/lacZ 对照质粒瞬时转染，筛选呈低基础表达和高诱导性的稳定 pSwitch 克隆。
 
Zeocin™

pGene/V5-His 质粒含有 Zeocin™ 抗性基因，因此可使用 Zeocin™ 筛选稳定转染子。

潮霉素 B

pSwitch 载体包含大肠杆菌潮霉素抗性基因 (HPH)（Gritz 和 Davies，1983），因此可使用潮霉素 B 筛选转染子（Palmer 等人，1987）。当添加到培养的哺乳动物细胞中时，潮霉素 B 作为氨基环醇发挥作用，通过干扰易位和促进错译而抑制蛋白质合成。潮霉素 B 随 GeneSwitch™ 完整试剂盒提供，亦可单独提供。

潮霉素 B 对光敏感。请在 +4℃ 下避光储存液体储备液。
潮霉素有毒。请勿摄入含有该药的溶液。处理潮霉素 B 和含潮霉素 B 的溶液时，请佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。
 
制备和储存潮霉素 B

GeneSwitch™ 完整试剂盒中包含的潮霉素 B 以 100 mg/mL 储备液形式提供（溶于经高压灭菌的去离子水中并通过过滤除菌）。溶液为棕色。在 +4℃ 下储存时，则能保证潮霉素 B 可稳定保持6个月。含潮霉素 B 的培养基最多可稳定保持6周。
 
确定抗生素敏感性

为成功生成表达 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 调节蛋白和目标重组蛋白的稳定细胞系，您需要确定杀死未转染宿主细胞系所需的各筛选剂（Zeocin™ 和潮霉素 B）的最低浓度。对于每种筛选剂，对一系列浓度（见下文）进行试验，以确保您能够确定细胞系所需的最低浓度。使用以下方案，确定杀死亲本细胞系所需的 Zeocin™ 和潮霉素 B 的最低浓度。潮霉素 B 的制备和储存说明见上文。

备注：通常，50-1000 mg/mL 浓度范围内的 Zeocin™ 和 10-400 mg/mL 浓度范围内的潮霉素 B 足以杀死大多数未转染的哺乳动物细胞系。

1. 铺板或分流汇合的培养板，从而细胞达到约 25% 汇合度。对于每种筛选剂，制备一组7个平板。让细胞贴壁过夜。


2. 第二天，向同组各平板中加入以下浓度的抗生素：
   • 使用 Zeocin™ 进行筛选时，Zeocin™ 试验浓度包括 0、50、125、250、500、750 和 1000 mg/mL
   • 使用潮霉素进行筛选时，潮霉素 B 试验浓度包括 0、10、50、100、200、400、600 mg/mL




3. 每 3-4 天补充选择性培养基，并观察存活细胞的百分比。


4. 请注意要定期计算存活细胞的百分比，以确定各筛选剂的适当浓度，从而能在添加抗生素后 1-2 周内杀死细胞。

 
Zeocin™ 对敏感细胞和抗性细胞的影响

Zeocin™ 的杀伤方法与其他抗生素（包括潮霉素 B、Geneticin® 和杀稻瘟菌素）截然不同。细胞不会变圆和从培养板上分离。敏感细胞暴露于 Zeocin™ 后可能表现出以下形态变化：

• 大小显著增加（类似于巨细胞病毒感染允许细胞的影响）以及细胞形状异常
• 细胞质中存在大空囊泡（内质网和高尔基体或其他支架蛋白分解）
• 质膜和核膜分解（这些膜上出现许多孔）

最终这些"细胞"将完全分解，仅留下蛋白质"串"。Zeocin™ 抗性细胞应能够继续定期分裂，形成明显的集落。与未经 Zeocin™ 筛选的细胞相比，Zeocin™ 抗性细胞不应存在任何明显的形态变化。

对 pSwitch 进行线性化的可能位点
      
为获得稳定的转染子，我们建议在转染前对 pSwitch 质粒进行线性化。虽然线性化载体可能不会提高转染效率，但可增加载体在整合时不会对 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 基因融合或哺乳动物细胞表达所需的其他元件产生干扰的可能性。下表列出了可用于在转染前对 pSwitch 质粒进行线性化的独特位点。还可使用其他限制性酶切位点。

对 pGene/V5-His A、B 和 C 进行线性化的可能位点
   
我们建议您在转染前也对 pGene/V5-His 构建体进行线性化。下表列出了可用于在转染前对质粒进行线性化的独特位点。还可使用其他限制性酶切位点。请注意，指示了 pGene/V5-His A、B 和 C 版的切割位点。确保您的插入片段不含您要用于对载体进行线性化的限制性内切酶位点。

*Angewandte Gentechnologie Systeme


筛选稳定整合子

确定用于筛选的 Zeocin™ 和潮霉素 B 适当浓度后，您可生成表达 pSwitch 和 pGene/V5-His 构建体的稳定细胞系。我们建议您首先生成表达 pSwitch 的稳定细胞系，然后使用该细胞系作为 pGene/V5-His 构建体的宿主。如果您希望进行共转染并对稳定整合子进行双重筛选，请见下文。

1. 使用所选方法，将 pSwitch 转染到所选哺乳动物细胞系中。纳入一块包含未转染细胞的培养板作为阴性对照。


2. 转染后24小时，洗涤细胞并向细胞中加入新鲜培养基。


3. 转染后48小时，将细胞分流转移至新鲜培养基中。分流细胞以使细胞汇合度不超过 25%。如果细胞密度太高，抗生素将不会杀死细胞。


4. 在 37℃ 下孵育细胞至少 2-3 小时，直至其附着在培养皿上。移除培养基，添加含有细胞系所需预定浓度潮霉素 B 的新鲜培养基。


5. 每 3-4 天为细胞补加选择性培养基，直至可识别集落。


6. 采用 pGene/V5-His/lacZ 阳性对照质粒瞬时转染，挑选至少20个潮霉素抗性集落并扩增每个克隆，以检测米非司酮诱导性基因表达。筛选基础转录水平最低和在加入米非司酮后 β-半乳糖苷酶表达水平最高的克隆。


7. 获得表达 GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 融合蛋白的稳定细胞系后，您可使用此细胞系分离通过 pGene/V5-His 构建体表达目标基因的稳定细胞系。重复上述步骤 1-6，使用您的 pGene/V5-His 构建体和 Zeocin™ 筛选集落。请记住同样要在含潮霉素的培养基中维持培养您的细胞。


8. 挑取并扩增至少20个集落，以检测受米非司酮调节的基因表达。

 
双重筛选稳定整合子

我们建议使用上述方案生成双重稳定细胞系。然而，如果您想进行双重筛选，您可以同时将 pSwitch 和 pGene/V5-His 表达质粒按照 1:1 的比例共转染到所选细胞系中，并使用潮霉素 B 和 Zeocin™ 筛选双重稳定转染子。（参见下文的备注）。使用适当的蛋白质分析方法（如蛋白质印迹法、酶反应分析法），筛选至少40个受米非司酮调节目标基因表达的细胞集落。

相较于单一抗生素筛选，某些细胞可能对双重筛选更敏感；因此，您可以使用更低浓度的潮霉素 B 和 Zeocin™ 对转染子进行双重筛选。分离出同时含有 pSwitch 和 pGene/V5-His 构建体的稳定细胞系并检测米非司酮诱导性目标基因表达后，我们建议您设定一个米非司酮诱导时间段来优化目标蛋白的表达（如，0、12、24、48、72小时等）。如前所述，在您的细胞系中使用适当浓度的米非司酮。在使用 1 x 10-8 M 米非司酮处理24小时后，我们在双重稳定细胞系（用 pSwitch 和 pGene/V5-His/lacZ 转染的 NIH3T3 细胞）中观察到多达 50-200 倍的 β-半乳糖苷酶诱导。应注意，诱导水平可能因您的目标基因的性质以及您选择的特定克隆而异。
 
在使用 1 x 10-8 M 米非司酮诱导24小时后，我们在双重稳定细胞系（用 pSwitch 和 pGene/V5-His/lacZ 转染的 NIH3T3 细胞）中观察到 β-半乳糖苷酶的持续表达，即使从组织培养基中移除米非司酮后也是如此。在无米非司酮的情况下培养细胞144小时后，仍可检测到高水平的 β-半乳糖苷酶蛋白。如果您想要对目标基因进行重复诱导实验，GeneSwitch™ 系统可能不适用于此用途。鉴于结果可能因目标基因和宿主细胞系的性质而异，有必要进行经验实验。
 
制备细胞以供裂解

在 ProBond™ 或 Ni-NTA 上对蛋白质进行纯化前，请按照以下步骤制备细胞以供裂解。您需要约 5 x 10⁶ 至 1 x 10⁷ 个稳定转染的细胞用于在 2 mL ProBond™ 或 Ni-NTA 纯化柱中纯化蛋白质。

1. 将细胞接种至5个 T-75 培养瓶或 2-3 个 T-175 培养瓶中。


2. 在选择性培养基中培养细胞，直至细胞生长至汇合度达到约 50%。


3. 添加适当浓度的米非司酮并诱导目标蛋白表达至所需水平。


4. 收获细胞，方法如下：利用胰蛋白酶-EDTA 处理细胞 2-5 分钟，或者刮取细胞置于 PBS 中。


5. 用新鲜培养基稀释（如有必要）使胰蛋白酶失活，并将细胞转移至无菌微量离心管中。


6. 以 1500 rpm 离心细胞5分钟。将细胞沉淀重悬于 PBS 中。


7. 以 1500 rpm 离心细胞5分钟。可立即裂解细胞，或在液氮中冷冻并储存于 -70℃ 下备用。有关样本制备的指南，请参阅 ProBond™ 或 Ni-NTA 手册

利用 pGene/V5-His A、B 和 C 载体，可以包含 C 端肽的框内克隆您的目标基因。目标基因的表达受 GAL4 UAS 和 E1b TATA 盒控制。该载体还包含一个合成内含子，用于增强基因的表达。如需 pGene/V5-His A、B 和 C 的完整核苷酸序列，可从我们的网站下载或联系技术服务部门。
 
pGene/V5-His 的特征

下表描述了 pGene/V5-His 的相关特征。所有特征均经过功能检测。

pSwitch 图谱是一个 7323 bp 载体，在 GAL4 上游激活序列 (UAS) 和单纯疱疹病毒胸苷激酶 (TK) 最小启动子的控制下，表达由酵母 GAL4 DNA 结合域 (DBD)、截短人孕激素受体配体结合域 (hPR-LBD) 和人 NF-kB p65 激活域 (AD) 组成的 73 kDa 融合蛋白。该载体还包含一个合成内含子，用于增强融合基因的表达。如需 pSwitch 的完整序列，可在此下载或联系技术服务部门。
 
pSwitch 的特征

下表描述了 pSwitch 的相关特征。所有特征均经过功能检测，并且载体已经过完全测序。

GAL4 DNA 结合域

酿酒酵母 GAL4 基因编码的转录因子可激活酵母中半乳糖分解代谢所需基因的表达（Laughon 和 Gesteland，1984）。GAL4 蛋白通过以同源二聚体的形式与这些基因上游激活序列 (UAS) 中的特定17核苷酸 GAL4 结合位点结合而调节靶基因的转录（Giniger 等人，1985；Marmorstein 等人，1992）。通过图谱分析，已将对 GAL4 的 DNA 结合功能定位到该蛋白的 N 端部分（Carey 等人，1989）。
GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 融合基因包含一个编码 GAL4 基因 1-93 位氨基酸的 DNA 片段。研究表明，GAL4 蛋白的这一部分包括负责 DNA 结合（1-65 位氨基酸）（Keegan 等人，1986）、二聚化（65-93 位氨基酸）（Carey 等人，1989）和核定位（1-29 位氨基酸）（Nelson 和 Silver，1989）的区域。
 
人孕激素受体配体结合域

人孕激素受体（Kastner 等人，1990；Misrahi 等人，1987）是类固醇和甲状腺激素受体超家族的成员（Evans，1988；Truss 和 Beato，1993）。在没有配体的情况下，孕激素受体位于细胞核内，为无活性形式（Guiochon-Mantel 等人，1989；Perrot-Applanat 等人，1985）。存在同源配体、孕激素和其他孕激素激动剂的情况下，孕激素受体发生构象变化，转换为活性形式。然后，配体结合的受体发生同源二聚体化，作为转录因子调控参与细胞增殖和分化的基因表达（Evans，1988；Simons，1998）。孕激素受体的配体结合功能位于该蛋白的 C 端部分（640-933 位氨基酸）（Vegeto 等人，1992）。合成孕激素拮抗剂（包括米非司酮）也能在该区域与孕激素受体结合（Vegeto 等人，1992）。
 
GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 融合基因的配体结合域部分编码人孕激素受体的 640-914 位氨基酸。这一 hPR-LBD 片段缺失了天然 hPR-LBD C 端的19个氨基酸，允许截短 hPR-LBD 与米非司酮和其他合成孕激素拮抗剂以高亲和力结合，但不能与孕激素或其他内源性类固醇激素结合（Wang 等人，1994；Wang 等人，1997）。
 
人 p65 激活域

最初确定与 rel 癌基因相关的人 p65 蛋白编码第二信使 NF-kB 的亚基（Ruben 等人，1991）。NF-kB 由在两种蛋白 p65 和 p50 之间形成的异源二聚体组成，作为真核生物中的多效性转录激活因子发挥作用（Baeuerle，1991）。NF-kB 与抑制剂 IkB 形成复合物，以无活性形式位于细胞质中（Baeuerle 和 Baltimore，1988）。IkB 通过 p65 蛋白与 NF-kB 结合。除与 IkB 相互作用外，p65 蛋白还负责 NF-kB 的转录激活功能（Schmitz 和 Baeuerle，1991）。GAL4-DBD/hPR-LBD/p65-AD 融合基因包含的 p65 部分编码该蛋白的 283-551 位氨基酸。在此蛋白的这一区域已鉴别出两个不同的反式激活域（Schmitz 和 Baeuerle，1991）。

米非司酮（11b-[4-二甲基氨基]苯基-17b-羟基-17-[1-丙炔基]雌甾-4,9-二烯-3-酮）是合成的 19-去甲类固醇，与人孕激素受体 (Kd <1 x 10-9 M) 和糖皮质激素受体 (Kd <1 x 10-9 M) 以高亲和力结合，同时作为孕激素和糖皮质激素拮抗剂发挥作用（Baulieu，1989）。米非司酮也称为 RU 486，其在高剂量 (3-10 mg/kg) 下用作堕胎药（Baulieu，1989；Philibert 等人，1985）。

在 GeneSwitch™ 系统中，米非司酮用作激动剂，通过与截短人孕激素受体结合而激活基因转录（Wang 等人，1997）。在 GeneSwitch™ 系统中，用于诱导基因表达的米非司酮浓度极低 (1 x 10-8 M)，无毒性，并且对缺乏内源性孕激素和糖皮质激素受体的哺乳动物细胞不会产生已知的多效性作用（Wang 等人，1994）。
 
分子量、分子式和结构

米非司酮的分子式为 C29H35NO2，分子量为429.6。米非司酮的结构见下图。






处理米非司酮

• 米非司酮有毒。请勿摄入或吸入粉末或含有此药的溶液。
• 处理大量米非司酮 (> 100 mg) 时务必小心。高剂量（见上文）米非司酮可能会损害生育力，并可能对胎儿造成伤害。
• 处理米非司酮和含米非司酮的溶液时，请始终佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。

制备和储存储备液

米非司酮随 GeneSwitch™ 完整系统和核心系统一起提供，但也可单独购买 100 mg 等分试样（货号 H110-01）。制备米非司酮：
 

1. 取 100 mg 米非司酮等分试样，重悬于 233 mL 的 100% 乙醇中，制得 1 mM (1 x 10-3 M) 米非司酮储备液，溶液澄清。请勿加热。


2. 取 100 mL 的 1 mM 米非司酮储备液，稀释到 10 mL 的 100% 乙醇中，制得 10 mM (1 x 10-5 M) 米非司酮工作溶液。在向细胞中添加米非司酮时，请使用此工作溶液。


3. 将 1 mM 米非司酮储备液和 10 mM 米非司酮工作溶液置于 -20℃ 下储存，以防止蒸发。这些溶液可以一直维持稳定。

Zeocin™ 是从链霉菌属中分离出的博来霉素/腐草霉素抗生素家族的一员。该家族的抗生素是广谱抗生素，可用作强效抗菌和抗肿瘤药物。它们对细菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞具有强烈的毒性（Baron 等人，1992；Drocourt 等人，1990；Mulsant 等人，1988；Perez 等人，1989）。
 
已分离出 Zeocin™ 抗性蛋白并进行了表征（Calmels 等人，1991；Drocourt 等人，1990）。这种 13.7 kDa 蛋白质是 Sh ble 基因（印度斯坦链异壁菌博来霉素基因）的产物，可结合 Zeocin™ 并抑制其 DNA 链切割活性。当真核和原核宿主细胞表达该蛋白质时会对 Zeocin™ 产生抗性。
 
分子量、分子式和结构

Zeocin™ 的分子式为 C60H89N21O21S3，分子量为1,535。Zeocin™ 的结构见下图。
 




Zeocin™ 的应用

Zeocin™ 用于哺乳动物细胞（Mulsant 等人，1988）、植物（Perez 等人，1989）、酵母菌（Baron 等人，1992）和原核生物（Drocourt 等人，1990）的筛选。建议用于哺乳动物细胞系和大肠杆菌筛选的 Zeocin™ 浓度如下：

*为实现高效筛选，要求 NaCl 浓度不超过 5 g/L (< 90 mM)                    

处理 Zeocin™

• 高盐和高酸度或高碱度会导致 Zeocin™ 失活，因此，我们建议您减少细菌培养基中的盐含量，并将 pH 值调节至7.5，以保持药物活性（参见低盐 LB 培养基）。请注意，制备含有 Zeocin™ 的组织培养基时无需调节盐浓度和 pH 值。
• 将 Zeocin™ 储存在 -20℃ 下，在使用前置于冰上解冻。
• Zeocin™ 对光敏感。避光储存药物、培养板和含有药物的培养基。
• 处理含有 Zeocin™ 的溶液时，请佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。
• Zeocin™ 有毒。请勿摄入或吸入含有该药物的溶液。
• 请在 +4℃ 下避光储存含有 Zeocin™ 的组织培养基。含有 Zeocin™ 的培养基可保持稳定 1-2 个月。 

订购信息

Zeocin™ 可从赛默飞世尔科技购得。为方便您使用，该药物在经高压灭菌的去离子水制备而成，可提供 1.25 mL 等分试样，浓度为 100 mg/mL。Zeocin™ 溶液呈蓝色。如果将 Zeocin™ 储存在 -20℃ 下，则能保证 Zeocin™ 维持6个月的稳定性。
 
 含量         货号
 1克             R250-01
 5克           R250-05

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