Datos de muestras del sistema de cuantificación fluorimétrica Qubit

Exactitud y precisión de los fluorímetros Qubit. La exactitud se evaluó como desviación media de la concentración real mediante el ensayo Qubit de dsADN HS, mientras que la precisión se evaluó como coeficiente de variación (CV) a través de repeticiones de varias concentraciones mediante el ensayo Qubit de dsADN BR. Los bajos porcentajes de desviación demuestran la exactitud de los fluorímetros Qubit Flex y Qubit 4, mientras que los bajos porcentajes de CV demuestran su precisión, especialmente la del modelo Qubit Flex. De los tres instrumentos que se probaron, el instrumento de la competencia era el que tenía la precisión y exactitud más bajas.

Precisión y sensibilidad de Qubit dsADN frente a la absorbancia UV. Se analizaron diez réplicas de ADN lambda a concentraciones conocidas de 0,01 a 10 ng/μL mediante el ensayo Qubit de dsADN HS del fluorímetro Qubit (barras azules) de acuerdo con el protocolo estándar del kit. Las mismas concentraciones de ADN se midieron mediante absorbancia UV en 10 réplicas con un espectrofotómetro de microvolumen (barras azules) y se compararon los resultados tanto de precisión como de exactitud. Cada barra representa el promedio de 10 réplicas, mientras que las barras de error (casi indistinguible en las mediciones Qubit) representan sus desviaciones estándar. La escala del eje X representa las concentraciones conocidas de ADN en las muestras iniciales, antes de la dilución en los tubos de ensayo Qubit, mientras que la escala del eje Y muestra las concentraciones medidas. Las mediciones del fluorímetro Qubit fueron más exactas (y » x), sensibles (bajas concentraciones, recuadro) y precisas (barras de error mucho más pequeñas) que las mediciones de absorbancia UV.

Precisión, exactitud y sensibilidad del ensayo Qubit de microARN. Se realizaron seis experimentos para probar la exactitud y precisión del ensayo Qubit de microARN con siARN puro; aquí se muestran los resultados de un experimento típico. En este experimento, se midieron ocho réplicas de siARN de GAPDH en concentraciones conocidas de 0,1 μg/mL a 12 μg/mL mediante el kit de ensayo Qubit de microARN con el fluorímetro Qubit y mediante mediciones de A₂₆₀ en el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. El límite de detección para el instrumento NanoDrop se indica en 1,5 μg/mL; se muestran los resultados de concentración de siARN más bajos para su comparación. La exactitud para el ensayo Qubit de microARN estaba dentro del 15 % previsto. Los CV (una desviación estándar/promedio de 8 puntos de datos) fue del 0,63 % al 2,9 %. En los seis experimentos, la exactitud del ensayo Qubit de microARN se encontraba dentro del 15 % previsto y los CV fueron < 5 %.

Exactitud y amplitud del ensayo Qubit de microARN. Las concentraciones de siARN puro y muestras de miARN se determinaron por densidad óptica en un espectrofotómetro PerkinElmer™ en concentraciones que dieron un rendimiento de A₂₆₀ de 0,3 a 0,6. Las muestras se diluyeron y probaron con el ensayo Qubit de microARN en cuatro concentraciones conocidas diferentes. Los resultados muestran una cuantificación precisa de (A) cuatro moléculas de siARN monocatenario diferentes y (B) dos de siARN bicatenario y dos de miARN bicatenario.

Selectividad de los reactivos de ensayo IQ de ARN para ARN grande y pequeño. Se analizaron muestras por triplicado que contenías 100 ng/mL de ARNr (E. coli) y varias cantidades de siARN (0-50 ng/µL) con el ensayo Qubit IQ de ARN en el Qubit 4 Fluorometer. Los gráficos muestran (A) las unidades de fluorescencia relativa (RFU) y (B) las puntuaciones de IQ de estas muestras. Los datos muestran que los colorantes son específicos de ARN de gran tamaño (como el ARNr) y de pequeño tamaño (como el siARN) respectivamente y las puntuaciones de IQ están estrechamente relacionadas con el porcentaje de ARN de gran tamaño de la muestra.

Degradación de ARNr por ARNasa A con el tiempo, con medición a través del Qubit RNA IQ Assay. Se incubaron muestras por triplicado de soluciones de ARNr de 100 ng/mL con diferentes dosis de ARNasa A en la solución del ensayo final que contiene fluorocromos multiplexados y tampón de ensayo. (A) Las dosis más altas de ARNasa A provocó una degradación más rápida del ARN durante 60 minutos, como se refleja en su puntuación IQ de ARN. (B) La exposición a 10 fM de ARNasa A provocó una disminución gradual de la fluorescencia de ARN de gran tamaño durante la hora y un aumento correspondiente de la fluorescencia de ARN pequeño. (C) Con la exposición a 100 fM de ARNasa A, los cambios se produjeron más rápidamente.

El IQ de ARN es coherente con los resultados de RT-qPCR, mientras que el número de integridad de ARN (RIN) de Bioanalyzer™ no lo es. El ARN total (aislado del hígado humano) se ha tratado térmicamente a 75 °C con diferentes duraciones y se ha analizado mediante el sistema Agilent™ Bioanalyzer™ y el ensayo Qubit IQ de ARN. El análisis de RT-qPCR también se llevó a cabo mediante los ensayos de transcriptasa inversa RETROScript, TaqMan hHIF1α y hGAPDH. (A) Los datos del sistema Bioanalyzer muestran una rápida disminución de los picos de ARNr a lo largo del tiempo, lo que sugiere un deterioro de la integridad del ARN. (B) La comparación de RIN (puntos negros) y del IQ de ARN (triángulos grises), con resultados más detallados en el punto de tiempo de 40 minutos, muestra que no hay concordancia, con una rápida disminución de RIN, pero con IQ del ARN estable en gran medida con el tiempo. (C) Los resultados de RT-qPCR también fueron estables con el tiempo, de acuerdo con IQ de ARN, pero no con RIN.

Determinación exacta de la carga de proteínas a partir de mezclas complejas de proteínas. Se emplearon el Qubit Protein BR Assay y el ensayo estándar Bradford para determinar la concentración de proteínas de lisados de diferentes tipos de células de mamíferos: 293T, A549, HepG2, HeLa y iPSC. Los lisados se separaron mediante un Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris Mini Protein Gel y se marcaron con un No-Stain Protein Labeling Reagent. (A) La imagen del gel se adquirió a través del iBright FL1500 Imaging System y (B) los factores de normalización se determinaron mediante el Invitrogen iBright Analysis Software. El coeficiente de variación (CV) del Qubit Protein BR Assay fue significativamente inferior al del ensayo Bradford.