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マルチプレックス蛍光in situ ハイブリダイゼーション(FISH)により、単一検体において複数のターゲットのアッセイを行い、共局在化したシグナルを可視化することが可能となります。各ハイブリダイゼーションプローブに対してスペクトル的に異なる蛍光標識を使用したこのアプローチには、多色画像表示により、複数の遺伝要素または多様な遺伝子パターンの分離が可能となります。
Molecular Probes®では FISH Tag™ 検出キットをルーチンな解析用に、さらにTSAキットを極めてレアまたは少量のターゲット用に提供しています。
FISH Tag™検出キットには、マルチプレックスアッセイに最適なFISHプローブを作成するために必要なラベリング試薬およびバッファーが含まれています。シンプルなプロトコルでは、ニックトランスレーション(DNAプローブ用)またはin vitro 転写(RNAプローブ用)を使用して、アミン修飾したヌクレオチドを酵素的に取り込み、アミン反応性のAlexa Fluor®色素によりラベル化します。 | ![]() FISH Tag™ RNA およびTSA キットを、ホールマウントDrosophila 胚中で同時に使用した、マルチプレックスFISH 検出。 Krupple(マゼンダ)およびrhomboid(橙色)の発現が Alexa Fluor® 647 色素とFISH Tag™ RNA Kits およびAlexa Fluor® 555色素またはマルチカラーキットを使用して検出された。フルオレセイン標識したRNAプローブ(ChromaTide® フルオレセイン-12-UTP)によりdpp発現をラベルし、 Alexa Fluor® 488 チラミドとTSA™ Kit #2および 抗フルオレセイン/Oregon Green®、ウサギIgG 分画、horseradish peroxidaseコンジュゲートにより検出した。 |
レアまたは極めて小量のターゲット用には、チラミドベースのシグナル増幅(TSA™技術)を使用してFISHプローブの蛍光シグナルを増幅することが可能です。TSA™キットは、horseradish peroxidase(HRP)を使用してプローブハイブリダイゼーション部位において高密度の蛍光ラベリングを達成します。この技術は、少量のDNAおよびRNAターゲットに理想的であり、マルチプレックス法に利用可能です。 | ![]() ホルムアルデヒド固定し、Triton® X-100で透過処理したBPAE 細胞をヤギ血清でブロッキングし、核をDAPI(青色)で染色し、F-アクチンをAlexa Fluor® 488ファロイジン(緑色)でそれぞれ染色した。抗–golgin-97 IgG1のラベル化には、細胞間接着を示すために HRP–ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor® 594 チラミドを含むTSA™ Kit #5 を使用した(赤色)。 |
ラベル化したチラミド |
Horseradish peroxidaseコンジュゲート
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抗マウスIgG(ホスト: ヤギ) | 抗ウサギIgG(ホスト: ヤギ) |
ストレプトアビジン
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Alexa Fluor® 350 | T20917 | T20927 | T20937 |
Alexa Fluor® 488 | T20912 | T20922 | T20932 |
Oregon Green® 488 | T20939 | ||
Alexa Fluor® 546 | T20913 | T20923 | T20933 |
Alexa Fluor® 555 | T30953 | T30954 | T30955 |
Alexa Fluor® 568 | T20914 | T20924 | T20934 |
Alexa Fluor® 594 | T20915 | T20925 | T20935 |
Alexa Fluor® 647 | T20916 | T20926 | T20936 |
ビオチン-XX | T20911 | T20921 | T20931 |
ラベル化したチラミド |
Horseradish peroxidaseコンジュゲート
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抗マウスIgG(ホスト: ヤギ) | 抗ウサギIgG(ホスト: ヤギ) |
ストレプトアビジン
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Alexa Fluor® 350 | T20917 | T20927 | T20937 |
Alexa Fluor® 488 | T20912 | T20922 | T20932 |
Oregon Green® 488 | T20939 | ||
Alexa Fluor® 546 | T20913 | T20923 | T20933 |
Alexa Fluor® 555 | T30953 | T30954 | T30955 |
Alexa Fluor® 568 | T20914 | T20924 | T20934 |
Alexa Fluor® 594 | T20915 | T20925 | T20935 |
Alexa Fluor® 647 | T20916 | T20926 | T20936 |
ビオチン-XX | T20911 | T20921 | T20931 |
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4色蛍光in situDrosophila胚上でのハイブリダイゼーション後期胚盤葉ステージ(核サイクル14)の胚を4種類の異なるRNAプローブで標識した。
青:DNPでラベルしたsogに続き、
ウサギ抗–ジニトロフェニルKLH IgG 抗体、
Alexa Fluor® 647ニワトリ 抗ウサギIgG 抗体で検出。緑:ビオチンラベルしたindに続き、ストレプトアビジンHRPおよびAlexa Fluor® 350 チラミド(
TSA キット#27)を使用した。赤:
ジゴキシゲニンでラベルしたmshに続きヒツジ抗ジゴキシゲニン抗体、
Alexa Fluor® 488ロバ抗ヒツジIgG 抗体で検出 。黄
フルオレセインでラベルしたsnaに続きマウス抗フルオレセイン抗体、
Alexa Fluor® 555ヤギ抗マウスIgG 抗体で検出。画像は、カリフォルニア大学のDave Kosman氏およびEthan Bier氏のご厚意により提供されたものです。
| ホールマウントDrosophila胚における、5種類のRNAプローブを使用した、フルオレセインin situ ハイブリダイゼーション(FISH)による、5種類の遺伝子発現の同時検出。
赤:
アミノアリルUTP でラベルしたsogおよび
Alexa Fluor® 647 サクシニミジルエステル緑:DNPでラベルしたindに続き
Zenon® Alexa Fluor® 555ウサギIgGラベリングキットであらかじめラベル化した
ウサギ抗ジニトロフェニルKLH IgG 抗体を使用 。青:ビオチンでラベル化したenをHRPストレプトアビジンおよびAlexa Fluor® 405 チラミド(
TSA™ キット#39、T30952)で検出。黄:ジゴキシゲニンでwgをラベルし、ヒツジ抗ジゴキシゲニンIgG 抗体および
Alexa Fluor® 594ロバ抗ヒツジIgG 抗体で検出。マゼンダ:フルオレセインでmshをラベルし
マウス抗フルオレセイン/Oregon Green® IgG2a 抗体および
Alexa Fluor® 488ヤギ抗マウスIgG 抗体で検出。画像は、カリフォルニア大学のDave Kosman氏および Ethan Bier氏のご厚意により提供されたものです。
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サテライトプローブのヒト染色体1、15および17への in situ ハイブリダイゼーションの、チラミド増幅による検出。
染色体1、15 および17 へのサテライトプローブをニックトランスレーションにより、ビオチン-11-dUTP、
ChromaTide® Texas Red®-12-dUTPおよび
ChromaTide® Oregon Green® 488-5-dUTPでそれぞれラベルした。3つのプローブすべての同時ハイブリダイゼーションに続き、ビオチン化した1番染色体のプローブをHRP–ストレプトアビジンコンジュゲートおよび
Alexa Fluor® 546 チラミド(TSAキット#23)で検出。最初のTSA 検出ステップ由来のHRP活性は、1%の過酸化水素による30分間の処理により失活させた。次いで、Oregon Green® 488色素でラベルした17番染色体のプローブを
抗フルオレセイン/Oregon Green® 抗体に続きHRP-コンジュゲートしたヤギ抗マウス IgG 抗体およびAlexa Fluor® 594 チラミド(
TSA キット#5)で検出した。この2回目のTSA検出由来のHRP活性は、1%の過酸化水素による30分間の処理により失活させた。次いで、Texas Red® 色素でラベル化した15番染色体のプローブを
ウサギ抗Texas Red® 抗体に続きHRP-コンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgG 抗体およびAlexa Fluor® 488 チラミド(
TSA キット#12で検出した。
Hoechst 33258による対比染色後、画像の取得をDAPI、FITC、TRITC およびTexas Red® 色素に適切なフィルターを使用して行った。
| チラミドシグナル増幅によって検出された蛍光in situ ハイブリダイゼーション染色体スプレッドを、培養した線維芽細胞株MRC-5 から調製し、17番染色体に特異的な、ビオチン化したサテライトプローブでハイブリダイズした。
プローブの作成は
ChromaTide® ビオチン-11-dUTPの存在下において、ニックトランスレーションを使用して行った。TSAによる検出のために、ハイブリダイズした染色体スプレッドをHRP–ストレプトアビジンおよびAlexa Fluor® 488 チラミドを含む
TSAキット#22 (上パネル)またはHRP–ストレプトアビジンおよびAlexa Fluor® 546 チラミドを含む
TSAキット#23 (下パネル)を使用してラベル化した。
DAPIによる対比染色後、DAPI、FITCまたはTRITCに適切なフィルターを使用して画像の取得を行った。
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