样品经过纯化后，需要评估其纯化质量是否适合进一步电镜分析。此时标准生化方法并不能完全胜任，因为即使完整的复合物也可能是由成分不同的亚复合物组成的混合物，甚至同源复合物也可能具有许多不同的构象。

负染电子显微镜分析是一种在显微镜下评估纯化生物样品质量的便捷方法。这种筛选旨在定性评估颗粒组成和构象均一性，而这只能在显微镜下完成。

通常这种评估是在简易的配备侧插样品杆的显微镜（如 Thermo Scientific Talos L120C TEM）上进行的，因为筛选时通常一次一个载网，而实际花在显微镜上的时间很短。

冷冻电镜(Cryo-EM)单颗粒分析依赖于计算数千个相同颗粒图像的平均值，因此为了简化结构解析过程，应尽可能降低结构异质性。

虽然单颗粒分析工作流程可通过 3D 分类程序来减轻样品的部分异质性，但仍需对样品进行生化纯化（以分离目标蛋白）。

根据样品、电镜载网和其他使用条件，通常会使用几微升 50 nM 至 5 μM 浓度的蛋白溶液来制备冷冻电镜样品。

生物样品应在体内近似优化条件下（缓冲液组成等）保持活性，方可用于结构研究。也可利用合适的生化或功能检测方法来测试蛋白活性。

为了兼容电子显微镜真空条件并将各颗粒锁定在其天然状态，必须对含有样品的溶液进行冷冻固定。为了保存大分子结构，冷冻过程必须快速完成才能避免形成冰晶；在玻璃化过程中会形成非晶态固体，这对样品结构不会或几乎不会造成损伤。随后，样品必须一直储存在液氮温度下，以保持在含水的玻璃态状态从而避免损伤生物样品颗粒。

这一操作会产生冷冻水合样品，样品的各个分子在其中分布良好并嵌入极薄的无定形（玻璃状）冰层中。

整个过程可使用 Thermo Scientific Vitrobot 系统等半自动投入式冷冻，过程非常简单易操作。样品吸附时间、吸附力、相对湿度和温度等关键参数的控制有助于实现高质量玻璃化样品的可重复制备。

在开始高分辨率数据采集前，应先采用诊断冷冻电镜评估样品。这一步骤旨在定性评估样品是否是 二维平均分类的潜在目标，并获取初始低分辨率结构信息。

在这一步骤中会预筛选样品以评估以下属性；

• 蛋白浓度、稳定性和分布
• 冰的质量、厚度和载网各处的均一性

理想情况下，这种筛选在带有自动上样器的冷冻电镜系统上进行，因为这可以在不影响冰质的前提下筛选出多种冷冻条件。Thermo Scientific Glacios cryo-TEM 和 Thermo Scientific Talos Arctica cryo-TEM 非常适合此用途。

如果样品通过筛选，则可能需要采集更大的数据量来帮助进一步开展 2D 和 3D 分析。在此阶段仅需中等分辨率 3D 结构（> 3Å）。

此外，配备直接检测相机的 200 kV cryo-TEM 已被证明可产生高分辨率（<3 Å）数据。

Glacios 和 Talos Arctica 显微镜非常适合此类数据采集，并且在设计上支持与高分辨率 Thermo Scientific Krios cryo-TEM 稳健、无污染地内置连通。这便于在所有配备自动上样器的仪器间交换AutoGrid冷冻样品载网。 

Thermo Scientific Krios G4 冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）是一款高度稳定的 300 kV TEM 平台，全面配备行业前列的自动上样器（一种冷冻样品操作机械手），是高分辨率冷冻电镜的首选仪器。其长时间无人照看数据收集，可实现出色的样品通量和大规模数据采集。通过 Krios G4 Cryo-TEM，您能够获取极高分辨率的结构信息。

一旦筛选出合适的冷冻电镜载网，就会收集大量数据来获取极高分辨率的结构。Krios Cryo-TEM 内置连通设计确保整个单颗粒分析工作流程稳健无风险，包括从样品制备至图像采集和数据处理的优化。

大型科学设施便于您接触到前沿冷冻电镜技术和专业知识。

大分子三维重建依赖于对数以万计的颗粒物视图进行平均。为了成功、高效地进行重建，数据必须经过多步数据处理，计算成本高昂且需要适当的计算资源。

因此，为了支持在数据收集过程中生成 TB 级数据的冷冻电镜设施，在设计数据存储基础架构时必须谨慎考虑。此外，由于有如此庞大的数据需要处理，计算资源也至关重要。为此，我们专门开发了大量用于辅助数据处理的学术软件包。