介绍

刺激剂佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯（PMA）、离子霉素、布雷菲德菌素 A 和莫能菌素可促进转录因子活化，以实现细胞内信号传递，并使多种不同免疫细胞产生细胞因子。需要使用布雷菲德菌素 A 溶液来确保细胞内保留信号蛋白和细胞因子。布雷菲德菌素 A 是一种细胞内蛋白转运抑制剂。使用布雷菲德菌素 A 对正在培养的细胞进行培养，会阻碍向高尔基复合体（GC）的蛋白转运，并导致内质网（ER）中的蛋白积聚。在细胞体外活化的最后几小时中加入布雷菲德菌素 A，会增强细胞内细胞因子的检测。如果对分泌蛋白进行免疫检测（例如 ELISA、蛋白免疫印迹或多重蛋白检测），则无需使用布雷菲德菌素 A 对细胞进行处理。


材料

  1. 带通气盖的 T25 或 T75 无菌烧瓶（例如 Nunc EasYFlask 细胞培养瓶，T25，过滤器，货号：156367）
  2. RPMI 1640 培养基（例如 BenchStable RPMI 1640 培养基，货号：A4192301）
  3. 胎牛血清（例如 Gibco 胎牛血清，货号：26140079）
  4. 细胞刺激混合试剂：佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯（PMA）、离子霉素、布雷菲德菌素 A 和莫能菌素（例如含有或不含蛋白转运抑制剂的Invitrogen 细胞刺激试剂，货号：00-4975-93 或 00-4970-93）
  5. 布雷菲德菌素 A 溶液（例如 eBioscience 布雷菲德菌素 A 溶液，货号：00-4506-51）
  6. 细胞刮刀（例如 Nunc 细胞刮刀，货号：179693）


程序

  1. 在无菌条件下使用无菌技术，从全血（补充方案 A）或制备的淋巴组织（补充方案 B）中分离 PBMC。
  1. 在制备 RPMI 1640 完全培养基时，用胎牛血清（最终浓度达 10%）补充 RPMI 1640 培养基。使培养基的温度达到 37°C。
  1. 进行重悬，使 RPMI 1640 完全培养基中的细胞浓度达 3 x 106 个细胞/mL。根据将使用的烧瓶（T25 或 T75）尺寸，制备所需体积。
  1. 准备两个培养瓶：一个贴有“已刺激”（已活化）标签，另一个贴有“未刺激”（未活化）标签。
  1. 将细胞溶液（在步骤 3 中制备）均匀分至两个准备好的烧瓶中。
  1. 向已刺激（已活化）烧瓶中加入浓度为 1X 2 µL/mL 的细胞刺激混合物。
  1. 向已刺激烧瓶和未刺激烧瓶中各加入浓度为 1X 3 µL/mL 的布雷菲德菌素 A 溶液。
  1. 用通气过滤盖盖住两个烧瓶，并在 37°C 下，在 5% CO2 培养箱中培养 5 小时。
  1. 用细胞刮刀收集细胞。

方案提示：

在流式细胞术应用中，使用现成 固定缓冲液有助于改善细胞因子和转录因子检测。


补充方案 A：从全血中分离 PBMC

材料

  1. 磷酸盐缓冲液（例如 Gibco PBS (10X)，pH 7.4，货号：70011044）
  2. 15 mL 或 50 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管，货号：339650）
  3. Ficoll-Paque® 密度分离培养基
  4. 流式染色缓冲液（例如 eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）

步骤

  1. 在锥形管中，按至少 1:1 的比例使用 PBS 稀释血液样本。
  1. 往稀释的样本中加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque® 。
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管加入 PBS，洗涤细胞。
  1. 在 2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟，丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心，并用适量的RPMI 1640 完全培养基重悬，使细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

注意：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示：

使用自动计数仪显著提高了单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数， 见详细方案。


补充方案 B: 从淋巴组织中分离免疫细胞

材料

  1. 60 x 15 mm 细胞培养皿（例如 Nunc 皮氏细胞培养皿，货号：150340）
  2. 3 mL 塑料注射器或两个带毛玻璃的载玻片
  3. 细胞筛网（尼龙网）
  4. 15 mL 或 50 mL 锥形管（例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管，货号：339650）
  5. 流式染色缓冲液（例如 eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）

步骤

  1. 将组织（脾脏、胸腺、淋巴结）收集至含有 10 mL 流式染色缓冲液或专用缓冲液的细胞培养皿中。使用 3 mL 注射器柱塞按压组织，使其分离成单细胞悬液。或者使用 10 mL 流式染色缓冲液，将组织置于两个载玻片的磨砂面之间磨碎。
  1. 将细胞筛网放在 15 mL 锥形管顶部。转移细胞通过细胞筛网上，以去除细胞团块和碎片。
  1. 在 2-8°C 下 300-400 x g 离心 4-5 分钟。丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤3对细胞进行离心， 然后用适量RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

备注：

一般来说，机械性破坏淋巴组织足以制备单个细胞悬液。

备注：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。