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随着流式细胞术研究界努力提高流式Panel的复杂性，不同的支持技术正在变得可用以满足他们的科学需求。研究人员开始转向光谱流式细胞术分析仪，例如 Cytek Biosciences 提供的 Cytek Aurora 光谱流式细胞仪或 Sony Biotechnology 提供的 SA3800。光谱流式细胞仪利用每个荧光分子的固有发射模式来生成独特的光谱特征（图 1-3 中的比较示例）。然而，每台仪器都有不同的激光配置和光学灵敏度，这对于理解设计多色Panel和选择合适的流式细胞术荧光染料组合至关重要。在任何情况下，都需要单独的荧光参考对照，类似于传统细胞术中的单色对照，以便对多色流式Panel中的光谱特征进行去数据解析。因此，光谱流式细胞术分析依赖于对独特光谱特征的区分，而不是特定的发射通道进行检测，从而实现了许多以前难以或不可能分离的荧光组合的兼容性和区分，如 PerCP 和 PerCP-eFluor 710 所示（图1）。

备注：对于每个激光器，生成的每个光谱特征（图 1-3）显示事件的分布作为整个光谱中强度的函数。解释每个通道的配色方案类似于热图或密度图的配色方案。红色代表大多数事件具有荧光的强度，而黄色、绿色和蓝色代表事件数量的减少。每个激光器的检测器组都可以捕获额外的发射，从而区分荧光团，如红色框所示。然而，基于此信息，以相似波长发射的染料可以将扩散引入其他染料。有关在荧光团之间引入的扩散量的信息，请参阅实现有效流式Panel设计的工具。

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在光谱流式细胞术实验中可以更容易地复用各种等级的荧光探针和试剂。例如，当可用的标记试剂有限时，在更大的免疫表型分析流式Panel中，Invitrogen Alexa Fluor 647 染料现在可以与更大的荧光蛋白（例如 APC）结合使用（图 2）。当扩展流式Panel以识别亚谱系细胞类型和相关标记时，紫色激光可激发 Super Bright 抗体偶联物可以与 eFluor 450 和 Pacific Orange 等传统染料结合使用。流式细胞术抗体组是免疫表型实验的基础，但在常规仪器上的大型组中加入 CellTrace 等功能性试剂可能具有挑战性。光谱流式细胞仪可以通过利用其独特的光谱特征来更简单地整合功能试剂。我们的 Invitrogen 荧光试剂和检测产品组合是对快速发展的光谱细胞分析领域的完美补充，使细胞生物学家、免疫学家和癌症生物学家能够发现更深入的生物学奥秘。

Invitrogen 荧光探针能够阐明生物机制，例如细胞周期阶段、重要的细胞信号通路、细胞凋亡导致的细胞死亡、RNA 检测等。将这些探针与抗体染色相结合需要仔细校准和适当的生物控制。由于细胞自发荧光会干扰某些方案中的荧光检测，因此光谱流式细胞仪能够在分析过程中识别和去除自发荧光（参见图 3 中的 Invitrogen PrimeFlow RNA 示例）。在光谱分离过程中，可以去除自发荧光，以便更好地解析和识别来自相关荧光探针的真实信号。这种能力进一步使抗体标记与基于荧光的功能探针的组合方法能够阐明光谱流式细胞术实验期间的生物学意义。

很多 Invitrogen 试剂可以在您的光谱流式细胞术实验中结合使用。使用下面的选择指南，查找适用于 3 激光光谱流式分析仪的可用荧光染料和功能试剂*。很多列出的荧光团可以组合使用，但仍有一些不相容性。请参阅实现有效流式Panel设计的工具，以在设计多色流式Panel时帮助指导选择荧光染料。

与传统的流式细胞术一样，光谱流式细胞术能够进行活细胞分析，这在研究众多免疫 领域时至关重要。例如，当询问肿瘤微环境时，流式细胞仪检测是细胞因子分析、评估肿瘤特异性抗原、免疫检查点发现、CAR T 细胞治疗等有用方法。仔细设计光谱流式细胞术分析的流式Panel需要了解 仪器的功能、细胞谱系亚群、它们的预期抗原密度以及可用的抗体偶联物及其特性。下表中提供的信息旨在指导研究人员在使用 Cytek Aurora 3 激光器系统时为多色流式Panel选择细胞荧光染料。

表 1.可在光谱流式细胞术中同时使用的 20 个 Invitrogen 荧光染料的扩散矩阵。可显示染料之间的扩散水平的一种荧光染料矩阵。每行的荧光团影响该荧光团在列中的扩散。尽管矩阵中的所有染料都可以一起使用，但较深的红色阴影表示一种荧光团已经增加了向另一种荧光团的扩散，在设计流式Panel和解释数据时需要更加注意。

单击每个单元格以查看光谱特征的比较和染料交叉染色指数的降低百分比。光谱特征的比较是一种荧光团可能对另一种荧光团产生影响的良好指标，而染料交叉染色指数的降低百分比旨在用作分辨率的定量测量。通过了解一个荧光团的扩散（行）对另一个荧光团（列）分辨率的影响，选择可以组合使用的合适的荧光团要简单得多。在这个矩阵中，所有荧光团都针对相同的抗原 (CD4) 进行控制，旨在成为流式Panel设计中的一个有价值的参考点。

表 2.在光谱流式中 24 个荧光染料的复杂指数矩阵 当使用额外的荧光团扩展流式Panel时，请参考下面的荧光染料矩阵，它展示了染料之间的荧光扩散水平。每行的荧光染料影响该荧光染料在列中的扩散。尽管矩阵中的所有染料都可以一起使用，但较深的红色阴影表示一种荧光团已经增加了向另一种荧光团的扩散，在设计流式Panel和解释数据时需要更加注意。

表 3.不推荐在光谱流式细胞术中一起使用的 Invitrogen 试剂。上述扩散矩阵中的所有荧光染料都可以一起使用。然而，根据实验的需要和可用的抗体偶联物，可能需要进行调整。自定义流式Panel时，请参考下表作为指南。每个单元格都包含一系列不建议一起使用的流式细胞术荧光染料和活性染料。

图 4.光谱流式细胞术荧光染料染色指数 (SI) 比较。从全血中分离出 PBMC，并在 3 激光光谱流式分析仪上进行分析*。用 CD4 一抗进行染色，随后用二次荧光团标记。基于递减的 SI 值对所有抗体进行滴定和排序。就绝对值和与其他荧光染料的关系而言，染色指数可能因仪器而异。

* 显示的所有光谱流式细胞术数据均由 Cytek Biosciences 在 Cytek® Aurora™ 光谱流式细胞仪 3 激光系统上生成，并使用 SpectroFlo™ 软件进行分析。