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See how the enzyme was used in a SARS-CoV-2 research study by Xie X, Muruato A, Lokugamage KG, et al. (2020) An Infectious cDNA Clone of SARS-CoV-2. Cell Host Microbe S1931-3128(20)30231-6.
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶错配率极低，可确保DNA 序列的高度准确性。经NGS检测，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的相对保真度 超过 Taq DNA 聚合酶的 300 倍。
图 1. 市面上商业供应PCR酶相对于 Taq 酶的保真度比较。 使用不同的 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增 3.9kb 的序列，然后用 MuA 转座酶将得到的 PCR 扩增子片段化。在片段化过程中引入了由 12 个随机核苷酸组成的独特分子标签（UMI），以单独标记每个产物。经NGS测序后，将reads与正确序列比对，按照UMI 分组，以此发现扩增中的错误。只有当错误出现在同一UMI标记的所有reads中时，错误才得以识别确认；否则将作为测序错误而被丢弃。以 Taq DNA 聚合酶作为标准来衡量聚合酶的保真度。
了解高保真PCR及其应用。了解如何使用高保真 PCR 酶减少扩增错误。
Platinum SuperFi II 缓冲液的独特配方有助于减少 PCR 中繁琐的优化步骤。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶时，不再需要计算退火步骤的引物解链温度。按照一般的引物设计规则（图 2）得到的引物，无论引物序列如何，该创新的缓冲液均能够实现使用60°C的统一引物退火温度。当然如果在退火步骤中使用自己计算的 Tm 时，该缓冲液同样能确保成功进行扩增（数据未显示）。
图2.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶在 60°C 的通用退火温度下可获得具有高特异性和高产率的 PCR 产物。使用不同退火温度的引物对在 60°C 退火温度下从 50ng 人基因组 DNA中扩增 12 个靶标。所使用的分子量标准为是 Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。以上用于 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的退火温度是经使用 Tm 计算器计算得到的。
了解退火步骤在 PCR 中的重要性、如何使用特殊 PCR 缓冲液避免反应优化，以及缓冲液使用通用退火温度的优势。
由于使用创新型的反应缓冲液，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可使用通用的退火温度和灵活的延长时间，实现多个PCR反应的同时扩增。
图 3.借助通用 PCR 扩增方案节约时间和实现不同PCR反应的同时扩增。使用一般的PCR 试剂，扩增每个 DNA 片段都需要特定的扩增方案，这是由于需要不同的引物退火温度和延伸步骤；因此，在同一次 PCR 运行中通常不能将多个靶标一起进行扩增。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶，可以使用一种通用扩增方案将不同的 PCR反应同时进行扩增，该扩增方案使用60°C通用引物退火温度和按最长片段计算的延伸时间（图 4）。
图 4.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可以实现短片段和长片段的同时扩增。从 100 ng 人类基因组 DNA 中扩增 0.7 kb、2.0 kb、4.8 kb 和 14 kb 片段，均使用相同的扩增方案：98℃ 变性 10 秒，60℃ 退火 10 秒，72℃ 延伸 7 分钟。 延伸时间基于最长片段进行计算。
Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix 可实现 PCR 产物直接上样电泳，省去了 PCR 样品中加染料的环节，且有助于减少移液错误。绿色缓冲液与下游实验应用相兼容，包括DNA 测序、连接和限制性酶切和连接。
图 5.绿色预混液可实现 PCR 产物直接加样至凝胶中进行分析。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的预混液可提供含绿色缓冲液的形式，其中包含一种密度试剂和两种示踪染料。借助两种染料（蓝色和黄色），可以在电泳过程中轻松地观察 DNA 条带的迁移（如右图电泳5 分钟和 15 分钟的泳道）。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶错配率极低，可确保DNA 序列的高度准确性。经NGS检测，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的相对保真度 超过 Taq DNA 聚合酶的 300 倍。
图 1. 市面上商业供应PCR酶相对于 Taq 酶的保真度比较。 使用不同的 DNA 聚合酶通过 PCR 扩增 3.9kb 的序列，然后用 MuA 转座酶将得到的 PCR 扩增子片段化。在片段化过程中引入了由 12 个随机核苷酸组成的独特分子标签（UMI），以单独标记每个产物。经NGS测序后，将reads与正确序列比对，按照UMI 分组，以此发现扩增中的错误。只有当错误出现在同一UMI标记的所有reads中时，错误才得以识别确认；否则将作为测序错误而被丢弃。以 Taq DNA 聚合酶作为标准来衡量聚合酶的保真度。
了解高保真PCR及其应用。了解如何使用高保真 PCR 酶减少扩增错误。
Platinum SuperFi II 缓冲液的独特配方有助于减少 PCR 中繁琐的优化步骤。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶时，不再需要计算退火步骤的引物解链温度。按照一般的引物设计规则（图 2）得到的引物，无论引物序列如何，该创新的缓冲液均能够实现使用60°C的统一引物退火温度。当然如果在退火步骤中使用自己计算的 Tm 时，该缓冲液同样能确保成功进行扩增（数据未显示）。
图2.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶在 60°C 的通用退火温度下可获得具有高特异性和高产率的 PCR 产物。使用不同退火温度的引物对在 60°C 退火温度下从 50ng 人基因组 DNA中扩增 12 个靶标。所使用的分子量标准为是 Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。以上用于 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的退火温度是经使用 Tm 计算器计算得到的。
了解退火步骤在 PCR 中的重要性、如何使用特殊 PCR 缓冲液避免反应优化，以及缓冲液使用通用退火温度的优势。
由于使用创新型的反应缓冲液，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可使用通用的退火温度和灵活的延长时间，实现多个PCR反应的同时扩增。
图 3.借助通用 PCR 扩增方案节约时间和实现不同PCR反应的同时扩增。使用一般的PCR 试剂，扩增每个 DNA 片段都需要特定的扩增方案，这是由于需要不同的引物退火温度和延伸步骤；因此，在同一次 PCR 运行中通常不能将多个靶标一起进行扩增。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶，可以使用一种通用扩增方案将不同的 PCR反应同时进行扩增，该扩增方案使用60°C通用引物退火温度和按最长片段计算的延伸时间（图 4）。
图 4.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可以实现短片段和长片段的同时扩增。从 100 ng 人类基因组 DNA 中扩增 0.7 kb、2.0 kb、4.8 kb 和 14 kb 片段，均使用相同的扩增方案：98℃ 变性 10 秒，60℃ 退火 10 秒，72℃ 延伸 7 分钟。 延伸时间基于最长片段进行计算。
Platinum SuperFi II Green PCR Master Mix 可实现 PCR 产物直接上样电泳，省去了 PCR 样品中加染料的环节，且有助于减少移液错误。绿色缓冲液与下游实验应用相兼容，包括DNA 测序、连接和限制性酶切和连接。
图 5.绿色预混液可实现 PCR 产物直接加样至凝胶中进行分析。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的预混液可提供含绿色缓冲液的形式，其中包含一种密度试剂和两种示踪染料。借助两种染料（蓝色和黄色），可以在电泳过程中轻松地观察 DNA 条带的迁移（如右图电泳5 分钟和 15 分钟的泳道）。
由于酶的强劲扩增能力和出色的热启动技术，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可高产量地、高特异性地扩增多种不同长度的片段。基于抗体的 Platinum 热启动技术在最初的 PCR 变性步骤之前抑制酶的活性，防止非特异性扩增和引物降解，同时可确保目的片段的高产量扩增。
图 6.适用于扩增多种不同长度的片段Platinum SuperFi II DNA 聚合酶（左侧泳道）可高产量和高特异性地从 100 ng 人类基因组 DNA 扩增 0.3 kb 至 14 kb 的DNA 片段。同时使用其他 DNA 聚合酶扩增相同的靶标：A—Merck KOD Hot Start、B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit、C—PrimeSTAR GXL。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的高灵敏度可以实现低丰度 DNA 模板的检测，并获得准确的扩增结果。在起始材料有限或样品中目标 DNA 浓度较低的实验中，DNA聚合酶的高灵敏度是非常有利的。
图 7.从少量起始 DNA 中实现高灵敏度和可靠的扩增。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶（左侧泳道）可分别从 0.4 ng、2 ng、10 ng、50 ng 和 250 ng 人基因组 DNA中稳定扩增一个 2 kb 的片段（模板量显示在每个泳道上方）。同时使用其它DNA 聚合酶扩增相同的靶标：A—PfuUltra II Fusion Hot Start, B—HotStar HiFidelity DNA Polymerase Kit, C—Expand HiFiPLUS Enzyme Blend.预估的拷贝数约为每 0.4ng 人类基因组 DNA 中100 个拷贝。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶经设计含有 DNA 结合结构域，从而实现高持续合成能力，并增强对常见 PCR 抑制剂的耐受性，如氯化血红素（红细胞成分）、木聚糖（植物生物聚合物）和腐殖酸（土壤）。
图 8.Platinum SuperFi II DNA 聚合酶显示出对常见 PCR 抑制剂的高度耐受性。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶和其他高保真 DNA 聚合酶从 50 ng 人类基因组 DNA 中扩增出 2 kb 人类基因组 DNA 片段：A—Q5 Hot Start High-Fidelity， B—PrimeSTAR GXL，C—Merck KOD Hot Start，和 D—反应混合物中的 KAPA HiFi HotStart PCR Kit，反应混合物中包含 1—无抑制剂，2—腐植酸（4 µg/mL），3—血红素（20 µM），或者 4—胆盐（1 mg/mL）。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的室温稳定性得到增强，可实现高通量PCR扩增。其卓越的 Platinum 热启动技术可实现室温稳定性和酶的高特异性。
图 9.使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶配制的反应体系可在室温下保持稳定。从 50 ng 人类基因组 DNA 中扩增出一个 0.5 kb 的片段。配制 PCR 反应体系，并在室温下放置 0 小时和 24 小时，然后再通过Applied Biosystems ProFlex 热循环仪进行扩增。可以看到，即使在室温下放置 24 小时后，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶（泳道 P）也能获得高特异性和高产量的扩增结果。同时使用其它 DNA 聚合酶进行同样的实验：A—Q5 Hot Start High-Fidelity， B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit，C—PrimeSTAR GXL。所使用的分子量标准是 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶由于其酶的强扩增能力和使用特殊的缓冲液，可以高特异性地扩增各种序列。Platinum SuperFi II 缓冲液可扩增高 GC 含量的靶标，而无需添加 DNA 解链添加剂。
图 10.使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶强劲扩增富含 AT 和 GC 的靶标。从 50 ng 人类基因组 DNA 中扩增出 15 个具有不同 GC 含量的靶标，而未添加任何有助于 DNA 变性的添加剂。所使用的分子量标准为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
图 11.强劲扩增富含 GC 的靶标。Platinum SuperFi II DNA 聚合酶可对高GC含量靶标进行高特异性和高产量的扩增（左侧泳道），而未添加任何 DNA 解链添加剂。从 50 ng 人基因组 DNA 中扩增出四个富含 GC 的片段（长度分别为 0.74 kb、0.58 kb、0.71 kb 和 0.72 kb；GC 含量如上标注）。根据制造商推荐的用于高 GC 含量模板的 PCR 扩增方案，使用同类DNA 聚合酶同时扩增相同的靶标：A—PrimeSTAR GXL DNA Polymerase， B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit，使用针对高GC含量的特殊缓冲液， C—添加了 10% DMSO 的 Merck KOD Hot Start DNA Polymerase。所使用的分子量标记为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
由于其高持续合成能力和极低的错配率，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶是准确扩增长片段（长达 20 kb）的理想选择，其还可扩增更长的靶标（长达 40 kb），但可能需要进行一些优化，例如使用高质量的模板（纯净、新鲜和完整的模板）和新鲜的引物溶液。将引物浓度降低至 0.2 μM 也可以改善PCR扩增结果。
图 12.长片段扩增。使用Platinum SuperFi II DNA 聚合酶（泳道 P）成功地从 200 ng 人类基因组 DNA 中扩增出 20 kb 的靶标。使用相同的引物对，同类DNA 聚合酶也进行了测试：A—Q5 Hot Start High-Fidelity，B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit，C—Merck KOD Hot Start，E - D—PrimeSTAR GXL 和 E—PfuUltra II Fusion HotStart。所使用的分子量标记为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
图 13.扩增 >20 kb片段。使用Platinum SuperFi II DNA 聚合酶（泳道P）从 50 ng 的大肠杆菌基因组 DNA 中成功扩增出 30 kb 的靶标和 40 kb 的靶标。使用相同的引物对，同类DNA 聚合酶也进行了测试：A—Q5 Hot Start High-Fidelity，B—KAPA HiFi HotStart PCR Kit，C—Merck KOD Hot Start，E - D—PrimeSTAR GXL 和 E—PfuUltra II Fusion HotStart。所使用的分子量标记为 TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。
图 14.使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶对不同浓度模板进行多重 PCR扩增。从 2.5 ng、25 ng 和 250 ng 人类基因组 DNA 中（模板量显示在每个泳道上方）同时扩增15 个靶标（99 bp；131 bp；160 bp；199 bp；251 bp；300 bp；345 bp；400 bp；516 bp；613 bp；735 bp；908 bp；1,005 bp；1,190 bp；和 1,606 bp）。所使用的分子量标记为 TrackIt 100 bp DNA Ladder。
由于具有高特异性和高抑制剂耐受性，Platinum SuperFi II DNA 聚合酶能够高效扩增质量不佳的 DNA 模板，如福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）样本。
图 15.对FFPE 样本 DNA 的扩增。对于使用Invitrogen RecoverAll FFPE 总核酸分离试剂盒提取的 10 ng 小鼠 FFPE DNA， Platinum SuperFi II DNA聚合酶可从中成功扩增长达 0.4 kb 的片段。所使用分子量标记为 TrackIt 100 bp DNA Ladder。
Platinum SuperFi II DNA 聚合酶的缓冲液中含有共稳定组分。这种独特的缓冲液成分带来了多种优势：不需要 Tm 计算引物的Tm，对富含 GC 靶标的扩增能力更强，可扩增更长的片段，以及可使用通用 PCR 扩增方案更适合高通量 PCR扩增（表 1）。
表 1.Platinum SuperFi II 和 Platinum SuperFi DNA 聚合酶之间的比较。
| Platinum SuperFi II DNA 聚合酶 | Platinum SuperFi DNA 聚合酶 | |
|---|---|---|
| 保真度（vs. Taq） | 超出 300 倍 | 超出 300 倍 |
| 热启动修饰 | 是 | 是 |
| 需要Tm 计算器 | 否（60°C 下引物退火） | 是 |
| 通用 PCR 扩增方案 | 是 | 否 |
| 高 GC 含量模板扩增 | 是（无需 GC enhancer） | 是（推荐 GC enhancer） |
| 长片段扩增 | 长达 20 kb（性能得到增强） | 长达 20 kb |
| 室温稳定性 | 长达 24 小时 | 长达 24 小时 |
| 抑制剂耐受性 | 高 | 高 |
| 扩增子的 3‘ 端 | 平末端 | 平末端 |
| 残留 DNA（每 50 μL rxn） | ≤1 个细菌 DNA 拷贝 ≤ 0.3 个人类 DNA 拷贝 | ≤1 个细菌 DNA 拷贝 ≤ 0.2 个人类 DNA 拷贝 |
| Usage | Reference |
|---|---|
| Multiplex PCR for detection of S. aureus genes | Allam A, Fakhr A, Mahmoud M et al. (2021) Staphylococcus aureus nasal colonization among health care workers at an Egyptian tertiary care hospital. Microbes and Infectious Diseases 2(1):108–118. |
| PCR with gDNA and cDNA of fungal samples, followed by Sanger sequencing | Ferrara M, Gallo A, Perrone G et al. (2020) Comparative genomic analysis of ochratoxin A biosynthetic cluster in producing fungi: new evidence of a cyclase gene involvement. Front Microbiol 11:581309. |
| Usage | Reference |
|---|---|
| Amplification of bacterial full-length genes, followed by Sanger sequencing | Ferrara M, Haidukowski M, D'Imperio M et al. (2021) New insight into microbial degradation of mycotoxins during anaerobic digestion. Waste Manag 119:215–225. |
| Metabarcording of fish DNA from pumped deep-sea water | Kawato M, Yoshida T, Miya M et al. (2021) Optimization of environmental DNA extraction and amplification methods for metabarcoding of deep-sea fish. MethodsX 8: 101238. |
| Usage | Reference |
|---|---|
| Cloning of VH and VL regions of an immunoglobulin | Granel J, Lemoine R, Morello E (2020) 4C3 human monoclonal antibody: a proof of concept for non-pathogenic proteinase 3 anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in granulomatosis with polyangiitis. Front Immunol 11:573040. |
| RT-PCR with human liver and testis samples for microRNA expression analysis, followed by Sanger sequencing | Rubino E, Cruciani M, Tchitchek N (2021) Human ubiquitin-specific peptidase 18 is regulated by microRNAs via the 3'untranslated region, a sequence duplicated in long intergenic non-coding RNA genes residing in chr22q11.21. Front Genet 11:627007. |
| Usage | Reference |
|---|---|
| Multiplex PCR for detection of S. aureus genes | Allam A, Fakhr A, Mahmoud M et al. (2021) Staphylococcus aureus nasal colonization among health care workers at an Egyptian tertiary care hospital. Microbes and Infectious Diseases 2(1):108–118. |
| PCR with gDNA and cDNA of fungal samples, followed by Sanger sequencing | Ferrara M, Gallo A, Perrone G et al. (2020) Comparative genomic analysis of ochratoxin A biosynthetic cluster in producing fungi: new evidence of a cyclase gene involvement. Front Microbiol 11:581309. |
| Usage | Reference |
|---|---|
| Amplification of bacterial full-length genes, followed by Sanger sequencing | Ferrara M, Haidukowski M, D'Imperio M et al. (2021) New insight into microbial degradation of mycotoxins during anaerobic digestion. Waste Manag 119:215–225. |
| Metabarcording of fish DNA from pumped deep-sea water | Kawato M, Yoshida T, Miya M et al. (2021) Optimization of environmental DNA extraction and amplification methods for metabarcoding of deep-sea fish. MethodsX 8: 101238. |
| Usage | Reference |
|---|---|
| Cloning of VH and VL regions of an immunoglobulin | Granel J, Lemoine R, Morello E (2020) 4C3 human monoclonal antibody: a proof of concept for non-pathogenic proteinase 3 anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in granulomatosis with polyangiitis. Front Immunol 11:573040. |
| RT-PCR with human liver and testis samples for microRNA expression analysis, followed by Sanger sequencing | Rubino E, Cruciani M, Tchitchek N (2021) Human ubiquitin-specific peptidase 18 is regulated by microRNAs via the 3'untranslated region, a sequence duplicated in long intergenic non-coding RNA genes residing in chr22q11.21. Front Genet 11:627007. |
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