Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器

Bandmate Automated Western Blot Processor

蛋白质免疫印迹进行入新阶段

Invitrogen Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器是一种可编程的印迹振荡系统，可自动执行蛋白质免疫印迹处理中繁琐的手动操作步骤，包括封闭、洗涤和抗体孵育，从而节省时间。

自动蛋白质免疫印迹处理

自动蛋白质免疫印迹处理程序是一个手动操作的繁琐流程，涉及多轮洗涤和抗体孵育。如此多的步骤，使得在处理蛋白质免疫印迹时，特别是在一次处理多个印迹时，难以专注于其他的工作或实验。通常会针对感兴趣的蛋白质优化特定的实验方案和试剂。Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器无需专用试剂，可编程以匹配您当前的蛋白质免疫印迹实验方案。只需极少的工作量即可设置好 Bandmate 设备，可使用您当前的蛋白质免疫印迹处理试剂和实验方案来处理多达4个印迹，大大减少了手动操作时间（图1）。

点击图片放大

图1.Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器自动执行手动蛋白质免疫印迹处理中的多个手动操作步骤，可节省时间以投入到其他重要任务和活动中。图中比较了手动蛋白质免疫印迹处理（顶部）与自动处理（底部）的工作流程示例，每个步骤的时间因最终用户实验方案而异。与手动处理相比，Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器可节省大约20分钟的时间。节省的时间与防止关键节点中断的多个步骤自动化有关，从而使用户可以专注于处理实验方案中的其他工作。

* 备注：必须将封闭缓冲液物理添加到 Bandmate 样本托盘中，但在继续进行下一个一抗自动孵育步骤之前，将其从托盘中自动排空。

Bandmate 系统工作原理

封闭缓冲液、洗涤缓冲液和抗体溶液可以和往常一样制备。溶液制备完成后，必须将洗涤缓冲液加入洗涤缓冲液储液瓶中，该储液瓶将在整个处理程序过程中分配所需体积的洗涤缓冲液。接下来，将抗体溶液加入 Bandmate 试剂管中（每个微型印迹所需的一抗和二抗溶液体积低至 3.5 mL，或者每个中型印迹所需的体积低至 7.5 mL）。然后，将印迹膜放入单个样本托盘中，该托盘由摇臂托架框提供支撑。将封闭缓冲液直接添加到每个托盘中。如果在孵育步骤后需要回收抗体，可将抗体回收管（50 mL 锥形管）插入废液托盘的每一侧，以分别捕获一抗和二抗。为 Bandmate 设备设置必要的处理试剂后，可以利用预编程的实验方案、保存的定制实验方案或新创建的定制实验方案。设置好程序后，所有处理步骤均同步执行，无需进一步输入，设置好之后便可离开。

图2.Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器的关键部件：(1) 试剂管（抗体储液槽）(2) 洗涤缓冲液管 (3) 摇臂托架 (4) 托盘盖 (5) 样本托盘 (6) 试剂滑块 (7) 废液和回收漏斗托盘 (8) 废液槽（盖板后面的腔室）。

随着实验方案的进行，Bandmate 试剂管的密封底部被刺穿，以便直接将抗体输送到处理托盘中。必要时可通过试剂滑动条来回移动试剂管。孵育后，可通过废液和回收漏斗托盘将抗体输送到废液槽或通过漏斗进入抗体回收管（如果需要回收抗体用于未来实验）。利用这种独特的分液系统，抗体不会通过任何固定管道，从而极大限度减少了潜在的交叉污染。

Bandmate 处理器在孵育和洗涤步骤中提供一致的振荡运动。振荡运动加上独特的弧形孵育托盘，有助于尽量减少所需的抗体量。

还可将 Bandmate 处理器设置为在室温下运行或在冷藏室中彻夜运行。为方便起见，最终的洗涤缓冲液保存在处理托盘中，并保持振荡运动，以便印迹保持饱和，随时为检测步骤做好准备。Bandmate 处理器包含了同时处理多达4个小型印迹或2个中型印迹所需的一切用品。唯一需要的耗材是每次处理实验都要更换的 Bandmate 试剂管。

有关 Bandmate 系统操作的更多详细信息，请参阅快速入门用户指南或用户手册。

用户指南：Bandmate 处理器
手册：Bandmate 处理器

缩短手动操作时间

节省实验室中的宝贵时间，让您可以集中精力进行其他重要活动和实验。可编程的 Bandmate 系统可以自动执行其他手动封闭、洗涤和抗体孵育步骤。可同时处理 1-4 个小型印迹或 1-2 个中型印迹，有助于尽量提高通量。 Bandmate 的处理和收集托盘也可以轻松取下，便于快速清理。

无需重新优化条件

通过简单可靠的操作，可像往常一样对孵育步骤的时间进行编程，包括以下调整：

分液体积——高达 75 mL（适用于小型印迹），高达 150 mL（适用于中型印迹）；每步骤可编程多达10次重复
振荡速度——每分钟5至40次循环
孵育时间——1分钟至96小时（适用于可能需要整夜或更长时间的孵育）
处理温度——必要时可将系统置于 4°C 冷藏室中，无需使用专用试剂

与采用手动处理程序处理的印迹相比，使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器处理的小型印迹在多个探测靶标中均表现出相当的强度水平（图3）。

点击图片放大

图3.Invitrogen Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器与手动处理程序（在托盘和摇床平台上执行探测和洗涤步骤）处理的小型印迹比较。 制备2倍稀释系列的 HeLa 细胞裂解液（起始浓度 4.0 μg/μL），并将其上样到 Novex 4-20% Tris-甘氨酸凝胶（货号 WXP42012BOX）中，然后在 225V 下电泳约40分钟。使用 Power Blotter 系统（货号 PB0012）和 Power Blotter 预切膜和滤纸（货号 PB7220）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器处理一组印迹（总计4个），并与另一组手动处理的印迹（总计2个）进行比较。将膜封闭于 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液（货号37565）中。对于多通路荧光检测，使用以如下浓度稀释于 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液中的一抗混合物探测印迹：小鼠抗 STAT3 (1:1000)（货号 MA1-13042）、鸡抗钙网蛋白 (1:2000)（货号 PA1-903）和兔抗亲环蛋白 B (1:1000)（货号 PA1-027A）。此后，对以 1:5000 的比例稀释于 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液的二抗进行孵育，具体如下：山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号 A32729）、山羊抗鸡 Alexa Fluor 546（货号 A11040）和山羊抗兔 DyLight 800 4XPEG（货号 SA5-35571）。在 iBright FL1500 成像系统上进行膜成像。

与采用手动处理程序处理的印迹相比，使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器处理的中型印迹在多个探测靶标中均表现出相当的强度水平（图4）。

图4.Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器与手动处理程序（在托盘和摇床平台上执行探测和洗涤步骤）处理的中型印迹比较。制备2倍稀释系列的 HeLa 细胞裂解液（起始浓度 4.0 μg/μL），并将其上样到 Novex 4-20% Tris-甘氨酸凝胶 (WXP42020BOX) 中，然后在 225V 下电泳大约36分钟。使用 Power Blotter 系统（货号 PB0012）和 Power Blotter Select 转印膜组（货号 PB3210）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器处理一组印迹（总计2个），并与另一个手动处理的印迹进行比较。将膜封闭于 1X Clear Milk 封闭缓冲液（货号37587）中。使用以如下浓度稀释于 1X Clear Milk 封闭缓冲液中的一抗混合物探测印迹：兔抗 Hsp90 (1:5000)（货号 PA1-013）和小鼠抗 PDI (1:5000)（货号 MA3-019）。此后，进行二抗孵育：稳定型山羊抗兔 HRP 10 µg/mL (1:2500)（货号32460）和稳定型山羊抗小鼠 HRP 10 µg/mL (1:2500)（货号32430）。对于化学发光检测，使用 SuperSignal West Femto 底物（货号34096）孵育印迹。在 iBright FL1500 成像系统上进行膜成像。

日间和人员间一致性

在印迹间保持精确的封闭、洗涤和抗体孵育步骤时间具有挑战性。由于 Bandmate 系统的处理步骤可编程，因此，与手动蛋白质免疫印迹处理相比，这些步骤的精度可能会更高。随着精度提高，实验间的一致性也应提高，从而获得更可靠的结果。

图5.使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器处理印迹时，可确保印迹间蛋白质检测的一致性。制备2倍稀释系列的 HeLa 细胞裂解液（起始浓度 1.0 μg/μL），并将其上样到 Novex 4-20% Tris-甘氨酸凝胶 (WXP42012BOX) 中，然后在 225V 下电泳大约40分钟。使用 iBlot™ 2 转印膜组（货号 IB23002）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器按照预设实验方案对四个印迹进行处理。将印迹封闭于 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液液（货号37565）中。使用以如下浓度稀释于 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液中的一抗混合物探测印迹：兔抗 Hsp90 (1:5000)（货号 PA1-013）、鸡抗钙网蛋白 (1:4000)（货号 PA1-903）和小鼠抗 P23 (1:1000)（货号 MA3-414）。此后，使用以 1:5000 的比例稀释于 1X Blocker FL 的二抗进行孵育：山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号 A32729）、山羊抗鸡 Alexa Fluor 546（货号 A11040）和山羊抗兔 DyLight 800 4XPEG（货号 SA5-35571）。在 iBright FL1500 成像系统上进行印迹成像。

有助于节省珍贵抗体

借助 Bandmate 系统，处理小型印迹只需低至 3.5 mL 的一抗和二抗溶液，处理中型印迹只需低至 7.5 mL，且对检测灵敏度影响极小（图6）。

点击图片放大

图6.Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器高效处理每个小型印迹只需低至 3.5 mL 一抗，处理每个中型印迹只需 7.5 mL，且检测灵敏度无显著损失。制备2倍系列稀释的 HeLa 细胞裂解液（起始浓度 4.0 μg/mL），处理小型凝胶时将其上样到 Bolt 4-12% Bis-Tris-Plus 凝胶 (NW04122BOX) 中，处理中型凝胶时将其添加到 NuPAGE 4-12% Bis-Tris-Plus 凝胶 (WG1401BOX) 中，然后在 200V 下电泳大约22分钟。使用 Power Blotter 系统（货号 PB0012）和 Power Blotter Select 转印膜组（货号 PB3210）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。为使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器来检测一抗体积效率，针对小型印迹检测了三种不同体积的一抗（3.5 mL、5 mL 和 10 mL），针对中型印迹检测了两种体积的一抗（7.5 mL 和 15 mL）。针对每种体积，使用经过调整的实验方案处理印迹。将印迹封闭于 1X Clear Milk 封闭缓冲液（货号37587）中。使用以如下浓度稀释于 1X Clear Milk 封闭缓冲液中的一抗混合物探测印迹：小鼠抗 STAT3 (1:500)（货号 MA1-13042）、小鼠抗 PDI (1:2500)（货号 MA3-019）和兔抗亲环蛋白 B (1:1000)（货号 PA1-027A）。此后，进行二抗孵育：稳定型山羊抗兔 HRP 10 µg/mL (1:500)（货号32460）和稳定型山羊抗小鼠 HRP 10 μg/mL (1:500)（货号32430）。对于化学发光检测，使用 SuperSignal West Pico Plus 底物（货号34577）孵育印迹。在 iBright FL1500 成像系统上进行膜成像。

使用 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器可以收集和回收 90% 以上的起始抗体体积供将来重复使用。但是，连续重复使用抗体可能会导致靶标检测效果连续下降，应由最终用户进行验证（备注：连续重复使用抗体对靶标检测的影响可能因抗体而异）（图7）。

图7.Bandmate 系统能够在各自孵育步骤后捕获一抗和二抗，因此可以保留抗体溶液在未来的实验中重复使用。制备2倍稀释系列的 HeLa 细胞裂解液（起始浓度 4.0 μg/μL），并将其上样到 Bolt 4-12% Bis-Tris-Plus 凝胶 (NW04122BOX) 中，然后在 200V 下电泳大约22分钟。使用 Power Blotter 系统 (PB0012) 和 Power Blotter Select 转印膜组（货号 PB3210）将凝胶转印到硝酸纤维素膜上。为检测抗体回收准确度和检测效率，设置 Bandmate 自动蛋白质免疫印迹处理器方案以回收一抗，且同一种抗体使用三次。将印迹封闭于 1X Clear Milk 封闭缓冲液（货号37587），使用稀释于 1X Clear Milk 封闭缓冲液中的小鼠抗 PDI (1:2500)（货号 MA3-019）进行探测。此后，使用以 1:5000 的比例稀释于 1X TBST 中的二抗山羊抗小鼠 Alexa Fluor Plus 680（货号 A32729）进行孵育。在 iBright FL1500 成像系统上进行印迹成像。

用户指南：Bandmate 处理器
手册：Bandmate 处理器