球状体生成前的细胞系维持培养

从液氮中解冻后，将 SW480 细胞维持培养在 Nunclon Delta T25 细胞培养瓶内添加了 10% Gibco FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco DMEM 培养基中，经2次传代后接种用于生成球状体。然后遵循 ATCC 实验方案进行传代培养。

所需材料：

• Nunclon Sphera 96孔板
• 完全培养基（添加了 10% FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco DMEM 培养基）
• Gibco TrypLE 试剂
• 1X PBS
• I 型胶原蛋白（作为细胞外基质试剂）
• 配有旋转吊篮转头和96孔板支架的离心机
• Countess II 自动细胞计数仪或血细胞计数器
• 15/50 ml 离心管
• 多通道移液器

使用 I 型胶原蛋白（作为细胞外基质或 ECM）制备培养基：

• 根据细胞系的性质，可以在有或没有细胞外基质支持的条件下生成球状体。SW480 细胞需要粘附 ECM 才能在有限的 3D 空间内生长。此外，重要的是确定用于生成球状体的 I 型胶原蛋白或 ECM 的浓度。
• 一些细胞系在所有不同的细胞密度下可能只需一种浓度的 ECM，而 SW480 细胞所需的 ECM 取决于细胞数。在此，我们确定了生成不同尺寸的球状体所需的 I 型胶原蛋白用量。请使用下表作为参考，了解各细胞密度下所需的 I 型胶原蛋白用量。

• 根据您的细胞密度制备包含 I 型胶原蛋白的培养基，然后再继续实验方案。将培养基混合物储存于 4°C 下，在细胞接种前使用。始终建议每次制备新鲜的培养基混合物。

1. 在球状体生成当天，将指定培养瓶放入生物安全柜中。
2. 丢弃培养瓶中的用后培养基，用 1x PBS 洗涤细胞，并使用 1-2 ml TrypLE 试剂解离细胞。使细胞完全脱离表面。
3. 添加4倍体积的新鲜完全培养基，以中和 TrypLE 试剂。
4. 对细胞进行离心，向沉淀物中加入新鲜的完全培养基。
5. 使用 Countess II 细胞计数仪或血细胞计数器进行细胞计数。
6. 确保细胞存活率超过 >90%。 建议在保持良好细胞活力的条件下继续操作。

7. 不同的细胞密度可产生不同尺寸的球状体；因此可计算所需的细胞数并从主储备液中等分相应数量。使用接种计算器（如下）计算所需的细胞数。
8. 确保根据细胞密度将细胞等分到含 I 型胶原蛋白的培养基中。请参阅上表，了解适用于不同密度的 I 型胶原蛋白用量。
9. 将 200 µl 包含所需细胞数量的细胞悬液接种于96孔 Nunclon Sphera 微孔板的每个孔中，并进行标记。
10. 在室温下，使用推荐的微孔板支架在旋转吊篮转头中以 1,500 rpm 的转速对96孔板离心10分钟，然后在 37°C 和 5% CO₂ 的条件下孵育微孔板。
11. 将当天记录为第0天。

• 在无需更换任何培养基的情况下可维持培养球状体至第7天。至少每24小时观察一次球状体培养板，以监测形态变化。
• SW480 细胞从第3天开始生成球状体。 因此，建议从第3天至第7天收集球状体用于高通量检测。
• 最适合高通量检测的球状体直径应为 300–500 μm。这可能因接种密度而异。有关更多信息，请参阅下面的结果。

• 离心是将细胞聚集在一起形成球状体的重要步骤。因此，强烈建议接种后对培养板进行离心。
• 离心后，避免摇动培养板或者施加任何机械应力。否则会扰动球状体。
• 建议采用每孔 625–2,500 个细胞的接种密度，以获得直径为 300–500 μm 的球状体。
• 第7天之后，如果要延长球状体生长时间，则必须更换培养基。将 50% 的用后培养基更换为 50% 的新鲜完全培养基，以便进一步观察。
• 移液和等分应小心进行，不要扰动球状体。将吸头置于在孔的侧壁，可避免此问题。
• 对大量球状体进行铺板时，可以使用多通道移液器进行接种。