免疫组化（IHC）建议和技巧
获取高质量免疫组化（IHC）图像的五个步骤
1. 免疫组化（IHC）样品制备
组织样品的制备方法决定了如何用抗体检测抗原。选择满足预期实验结果需要的组织类型相兼容的固定方法是很重要的。如果您需要好的抗原修复结果并且不必保持细胞形态，则使用冰冻组织或丙酮固定。当需要保持细胞形态时，福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)组织样品是一个好的选择。
对于细胞固定，可选择：
问题：无染色或染色弱
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 切片过于陈旧 | 使用新鲜的切片；如果需要进行保存，保存在4°C |
| 玻片上的组织已干化 | 重新补充水分并在染色过程中保持组织被覆盖在缓冲液中 |
| 不均衡的背景染色可能意味着脱蜡不正常 | 使用新鲜的二甲苯并延长脱蜡时间 |
问题：高背景值
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 洗涤不充分；由于固定剂的残留而导致高的背景值 | 确保在步骤之间用PBS至少洗3次 |
| 固定不充分；可能会导致抗原在组织中的扩散 | 降低固定后时间 |
| 弥散染色；由组织损伤导致 | 小心制备组织样品以避免组织损伤 |
| 检测试剂的渗透不充分 | 制备更薄的切片 |
| 不同固定剂对于组织抗原影响各异 | 优化pH，孵育时间和温度 |
2. 免疫组化（IHC）抗原修复
抗原修复是免疫组化（IHC）在进行抗体标记前的必要步骤，因为组织的固定过程通常会引起蛋白交联。这在使用福尔马林固定时因其化学属性而经常发生，但可以通过加热（最常用的方法）、简易缓冲液处理或蛋白酶消化而轻松实现逆转。处理的方式可根据抗体检测所需的表位构型而进行选择。该步骤可使得抗原表位被重新暴露以便于抗体的结合。
问题：无染色或染色弱
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
由于固定步骤引起的蛋白交联导致抗原仍未被修复 | 使用正确的抗原修复方法（推荐通过微波）；压力锅也可以，但 不推荐使用水浴 |
3. 免疫组化（IHC）背景封闭
组织中内源性酶和抗体的封闭对于背景染色的最小化以及降低假阳性染色十分重要。这通常是通过用可封闭一抗或二抗也可能结合的非特异性位点的特定缓冲液对样品进行孵育而实现的。
封闭非特异性染色，可选用：
eBioscience IHC /ICC封闭液 - 低蛋白
eBioscience IHC /ICC封闭液 - 高蛋白
亲和素/生物素封闭试剂盒
CAS-封闭组化试剂
Blocker FL荧光封闭液
问题：高背景值
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 来自内源性过氧化物酶或磷酸酶的干扰 | 在使用抗体前采用溶于甲醇或水的3% H2O2或使用专门的试剂盒（如Thermo Scientific过氧化物酶抑制剂）进行淬灭；使用碱性磷酸酶抑制剂 |
| 来自内源性生物素活性的干扰 | 在进行一抗孵育前使用亲和素/生物素封闭试剂进行封闭 |
| 来自内源性酶的干扰 | 在加入抗体前把多余的缓冲液吸干而非对组织样品进行洗涤 |
4. 免疫组化（IHC）检测目标
在选择一抗时，确保其已通过验证可用于免疫组化（IHC）应用。Invitrogen抗体产品含有约60,000种经免疫组化（IHC）优化和测试的高质量抗体。一抗有非偶联的（用于间接法）以及偶联的形式用于直接检测或多重检测的方法。二抗也有一系列的偶联形式用于基于比色/发光或染色的免疫组化（IHC）。
每一种抗体都提供即用型的形式：
- 用于免疫组化（IHC）的Invitrogen抗体已有超过21,000次引用
- 具有稳定性能的免疫组化（IHC）实验验证过的抗体
- 在石蜡及冰冻切片中的功能性验证
- 一抗和二抗产品是对其他赛默飞产品在免疫组化（IHC）工作流程（完整工作流程，用于免疫组化的每一步）中的完善补充
- 免疫组化（IHC）抗体来源、仪器、试剂以及技术信息
- 升级后的网站可实现轻松搜索和订购
- Alexa Fluor及Alexa Fluor Plus偶合物为基于荧光的免疫组化（IHC）提供了众多选择
查找适合您免疫组化（IHC）应用的抗体：
除了抗原检测外，免疫组化（IHC）制备的组织切片也可用于细胞过程的分析。Click系列试剂，可通过结合EdU标记并通过传统的比色法染色，实现对于固定组织中细胞增殖的直接检测。此外，Click系列试剂与TUNEL标记的结合可用于发生在凋亡过程中片段化DNA的比色法检测。
增殖或凋亡的建议比色法检测，可选用：
问题：无染色或染色弱
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 一抗及二抗已失活 | 检查抗体的储存条件、污染情况、pH变化或者反复冻融的次数 |
| 一抗不适用于免疫组化（IHC）应用 | 确保使用的一抗可以用于免疫组化（IHC）应用 |
| 没有足够的抗体可对组织中的目标蛋白进行标记 | 根据产品数据单页的建议使用足量的抗体稀释液以及合适的浓度 |
| 一抗结合不足 | 增加抗体浓度或增加孵育时间至4°C过夜 |
| 一抗并未证实可用于各种组织制备（固定方法） | 确保一抗可用于免疫组化（IHC）应用以及需要开展的免疫组化（IHC）类型（福尔马林/PFA，新鲜，冷冻等） |
| 针对目标蛋白或一抗使用了错误的物种或同种型（如果使用了二抗） | 确保一抗和二抗之间的兼容性（物种及同种型兼容性） |
| 荧光信号的丢失 | 如果进行荧光免疫组化（IHC），确保二抗是被避光保存以防止信号的退化 |
| 组织中可能不存在目标蛋白 | 检查蛋白定位并采用阳性对照 |
| 组织中目标蛋白表达丰度低 | 使用偶联了生物素的二抗或偶联的链霉亲和素进行信号放大 |
| 磷酸化蛋白，需要特殊的磷酸化抗体孵育条件 | 确认目标蛋白的翻译后修饰情况并检查抗体特异性实验条件 |
| 抗原修复可能并没有对表位进行修饰，从而导致抗体未发生识别 | 使用另外不同的抗原修复方法（加热以及pH6或pH9的缓冲液，酶法等） |
| 目标蛋白是核蛋白，无法通过抗体进行检测 | 在封闭液和抗体稀释液中使用Triton-X来增加膜的通透性 |
| 高浓度的二抗会弱化抗原的检测 | 通过浓度梯度实验来进行信号强度的确认 |
| 标准HRP偶联的二抗可能无法提供足够的信号放大 | 使用基于聚合物的检测试剂，或基于亲和素/生物素的检测系统 |
| PBS缓冲液受到了细菌污染，导致蛋白磷酸化位点的破坏 | 确保所有使用的缓冲液无菌、清洁、新鲜；观察透明度 |
| 酶-底物反应受损 | 在HRP存在时避免使用含有叠氮化钠的缓冲液，并注意去离子水中可能会含有影响酶活性的过氧化物抑制剂 |
| 异常/非特异性结合 | 减少孵育时间或更换封闭试剂 |
问题：高背景值
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 一抗的非特异性结合；如果浓度过高则会导致高背景值或非特异性结合 | 对一抗进行更高比例的稀释并进行浓度优化 |
| 二抗的非特异性结合 | 减少使用用与二抗相同物种的正常血清处理组织，或使用Invitrogen预吸附的亲和纯化二抗 |
| 使用了同一物种的抗体（例如，对于小鼠组织使用了鼠抗） | 进行一抗孵育前，使用小鼠封闭试剂处理小鼠组织 |
| 高孵育温度 | 降低温度或在荧光免疫组化（IHC）中使用4°C孵育 |
| 荧光免疫组化（IHC）中福尔马林或多聚甲醛固定剂在绿色光谱上产生自发荧光 | 使用红色或红外光谱的荧光（如果检测系统可用） |
| 多克隆抗体的非特异性结合 | 使用单克隆抗体而非多克隆抗体以减少交叉反应 |
| 抗体浓度过高，导致非特异性结合 | 降低一抗或二抗的浓度以减少非特异性结合 |
| 底物浓度过高 | 减少底物孵育时间并进一步稀释底物；如果第一选择不可用，选择不同的酶/底物组合 |
5. 免疫组化（IHC）观察样本
Thermo Fisher Scientific可提供几款最为先进的显微镜，用于通过比色或荧光标记抗体组织染色的免疫组化（IHC）图像获取。
EVOS系列智能细胞成像分析系统：
- 用于简易观察发光染色：
- 用于简易观察荧光染色：
- 用于简易观察和分析发光染色和荧光染色：
问题：无图像
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 光源或光路设置不正确 | 激活光源或调整光路 |
| 未正确聚焦 | 调整聚焦 |
| 滤光片未正确调整 | 联系技术支持获取关于EVOS FL Auto 2成像系统的帮助 |
| 染色不正常 | 确保使用阳性对照来确认染色方法是否可行，并仔细检查可能缺失或错误的实验步骤；联系技术支持获取更多帮助 |
问题：图像不正常
| 可能原因 | 建议 |
|---|---|
| 物镜不干净 | 在进行观察前清理物镜 |
| 图像存在光学像差 | 检查盖玻片的厚度 |
| 荧光免疫组化（IHC）样品中存在发射光谱重叠 | 根据使用的标记选择合适的滤镜设置并从光谱的其他区域选择荧光通道 |
| 色原和封片剂不兼容导致信号腐蚀 | 检查底物和封片剂之间的兼容性；使用具有酶以及荧光标记的水相封片剂，或仅具有酶标记的有机封片剂；使用DAB底物和非水相封片剂，以及在复合分析中使用水相封片剂 |
| 封片剂和盖玻片折射率不兼容 | 尽量将封片剂的折射率（RI）与玻璃的折射率（RI=1.52）进行匹配，以获取好的组织透明度和图像质量；不同封片剂具有不同的折射率 |
仅供科研使用，不可用于诊断目的。